基于網絡藥理學的熟地黃環烯醚萜類成分治療類風濕性關節炎作用機制的初步探究

張冬麗，于歡，李敏，唐生安

（天津醫科大學天然藥物學系，天津市臨床藥物關鍵技術重點實驗室，天津300070）

類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種病因尚未完全闡明的系統性炎癥性自身免疫病，其主要特點是關節滑膜炎的產生、血管翳的形成和軟骨破壞。滑膜炎持久反復發作，導致關節內軟骨及骨的破壞，嚴重影響患者的生活質量和身體健康[1]。現代醫學藥物治療RA 主要有非甾類抗炎藥，如美洛昔康、塞來昔布；生物制劑，如依那西普、英夫利昔單抗和糖皮質激素等，這些藥物雖能緩解RA 病情，但具有一定的毒副作用。中藥具有多成分、多靶點、多途徑的治療特點，一定程度上可以彌補西藥帶來的不良反應，為進一步尋找抗RA 藥物提供新方向。

熟地黃（Rehmanniae Radix Praeparata）為玄參科、地黃屬植物。生地黃甘苦而寒，具有清熱涼血、養陰生津的作用；而熟地黃甘溫味厚，具有滋陰補血、益精填髓的功效[2]。根據RA 的證候特點不同，熟地黃多用于治療腎虛寒凝型、氣血虧虛型、寒濕痹阻型RA[3]。研究表明，六味地黃湯可以通過調節機體的免疫功能狀態、恢復免疫平衡實現治療自身免疫性疾病[4]。但由于自身免疫性疾病發病機制較復雜，熟地黃中有效成分和作用機制并不明確。因此，本文利用網絡藥理學對熟地黃環烯醚萜類成分進行篩選，預測其作用的與RA 有關的靶點及相關通路，構建“成分-靶點-通路”網絡圖，直觀地展示熟地黃環烯醚萜類成分主要作用的靶點和通路，預測其作用機制。

1 材料與方法

1.1 候選成分的虛擬篩選 首先通過查找文獻得知熟地黃環烯醚萜類成分有促進骨細胞的增殖、分化和免疫調節的作用[5]，提示熟地黃環烯醚萜類成分具有抗RA 活性。利用中藥系統藥理數據庫（TCMSP）檢索熟地黃成分，可以找到26個環烯醚萜成分，從中篩選出類藥性（DL）≥0.18 且具有較多作用靶點的5個成分，分別為：梓醇（1）、益母草苷（2）、桃葉珊瑚苷（3）、（2S，3R，4R，5S，6R）-2-{[（1S，4aS，5R，7aR）-4a，5-dihydroxy-7-methylol-5，7adihydro-1H-cyclopental9（c）pyran-1-yl]oxy}-6-methylol-tetrahydropyran-3，4，5-triol（4）、京尼平苷（5），結構見圖1。

圖1 熟地黃環烯醚萜類成分結構Fig 1 The structure of ilidoids from Rehmanniae Radix Praeparata

1.2 候選成分靶點預測 通過PubChem 數據庫查找候選成分相關的分子信息及生物學測試[6]和TCMSP 數據庫進而確定各成分潛在的作用靶點。采用UniProt KB 搜索功能得到這些靶蛋白的UniProt ID，基因名稱及其正確名稱。

1.3 靶點的篩選 在治療靶標數據庫（TTD）中輸入關鍵詞“rheumatoid arthritis”，可以得到有關RA的靶點信息；在DrugBank 數據庫中搜索美國食品藥品監督管理局（FDA）批準的抗RA 藥物的靶點，將兩個數據庫得到的與RA 相關的靶點信息進行整合。預測的候選成分的靶點與RA 相關靶點進行比對分析，得到靶點中有明顯抗RA 作用的靶蛋白，并統計頻次。

1.4 相關通路獲取及分析 將比對之后的靶蛋白的UniProt ID 導入生物學信息資源數據庫David（https://david.ncifcrf.gov/home.jsp），得到靶點的相關通路信息后進行GO 富集分析和KEGG 通路注釋分析。參數設置如下：Identifier：UNIPROT_ACCESSION；List Type：Gene List；Species：Homo sapiens（Human）。在分析報告的“Functional Annotation Chart”中通過P 值（P＜0.05 為差異有統計學意義）進行篩選。

1.5 “成分-靶點-通路”網絡構建 以選取的5個成分、比對分析過的靶點和通路建立相互關系，導入Cytoscape3.7.0 軟件，分析熟地黃環烯醚萜“成分-靶點-通路”的網絡圖。

2 結果

2.1 熟地黃環烯醚萜類成分的潛在靶點信息 將PubChem 數據庫中獲得的靶點信息與TTD 數據庫和DrugBank 數據庫中獲得的與RA 相關的靶點信息進行比對，得到13個重復靶點，即可能為熟地黃環烯醚萜類成分治療RA 的潛在作用靶點，見表1。

對比篩選出的各靶點的網絡節點度（Degree），腫瘤壞死因子（TNF）、白細胞介素（IL）-1β、IL-6、NF-κB 抑制蛋白α（IκBα）較高，為網絡中的樞紐節點，提示它們可能是熟地黃環烯醚萜類成分抗RA的關鍵作用靶點。在表1 的基礎上，對5個成分作用的靶點數進行歸納，見表2。

表2 熟地黃環烯醚萜成分的潛在靶基因和靶點數Tab 2 Potential target genes and target number from the iridoid constituents of Rehmanniae Radix Praeparata

5種化合物的母核都是環烯醚萜結構。由表2可知，桃葉珊瑚苷和京尼平苷的靶點數較多，與其他成分比較，提示桃葉珊瑚苷和京尼平苷具有相對較好抗RA 活性。可見熟地黃環烯醚萜的不同化學成分不僅可以作用于相同的靶點，也可作用于不同的靶點，體現了其多成分、多靶點的抗RA 機制。

2.2 熟地黃環烯醚萜成分潛在靶點的生物學過程和通路注釋分析 從13個靶點中篩選出9個靶點(JAK2、IκBα、IL-1β、IL-6、TNF、Bcl-2、TP53、TLR9、PTGS2)進行生物學過程分析和通路注釋分析，得到15 條通路信息及靶點的生物學過程，主要富集在炎癥反應、脂多糖調節的信號通路、凋亡過程、IL-6 產生的正向調控、NF-κB 轉錄因子活性的正向調控、NF-κB 導入細胞核的正向調控、NO 生物合成的正向調控等生物學過程。其中有5 條通路與RA 直接相關[7-9]，包括NF-κB 信號通路、TLR 信號通路、TNF 信號通路、NOD 樣受體信號通路和細胞凋亡，見表3。

表3 RA 相關信號通路所包含的靶基因Tab 3 Target genes involved in RA related signaling pathways

根據表3 可知，5 條通路與免疫調節和細胞凋亡相關，屬于細胞因子和細胞調節通路[10]，提示熟地黃環烯醚萜成分主要通過這兩類通路產生抗RA 活性。

靶點參與的主要通路注釋分析如圖2 所示。

圖2 KEGG 通路富集分析結果Fig 2 The result of KEGG pathway enrichment analysis

2.3 熟地黃環烯醚萜“成分-靶點-通路”網絡構建 圖中共29個節點，包括5個成分、9個靶點、15條通路。從圖3 中可以看出，除了2.2 中提到的6條與RA 直接相關的通路外，還涉及其他通路，比如甲型流感、肺結核、利什曼病、麻疹、單純皰疹感染、乙型肝炎、非洲錐蟲病等，這些通路與免疫系統、細胞生存與凋亡有關，從不同角度揭示了熟地黃環烯醚萜成分具有抗RA 活性的特點[11]。

圖3 熟地黃環烯醚萜“成分-靶點-通路”網絡圖Fig 3 “Components-targets-pathways”network of the iridoid constituents of Rehmanniae Radix Praeparata

3 討論

中醫藥歷經千百年的臨床實踐，積累了豐富的經驗。中藥及其方劑具有多成分、多途徑和多靶點協同作用等特點，在防治復雜疾病方面具有其自身的特色和優勢。網絡藥理學是一種系統的方法，它是以“疾病-基因-靶點-藥物”網絡模型的形式發展起來的，從多維的角度解釋和評價藥物的分子機制。它可以在靶點-通路識別以及說明藥物靶點相互作用等方面發揮作用，并利用藥物-靶點相互作用網絡闡明藥物的作用機制[12]。因此，在對傳統藥物進行作用機制的研究中，可以利用網絡藥理的方法，對其進行初步探索。

既往研究表明，許多細胞因子是RA 產生炎癥反應和關節損傷的重要介質，與RA 密切相關的細胞因子有IL-1、TNF-α、IL-6，而TNF-α 在炎癥反應中是關鍵的細胞因子，若抑制其產生，則IL-1、IL-6 的產生也會相對減少[13]。NF-κB 是一種重要的轉錄因子，可以促進其他炎癥因子，如TNF-α、IL-1β 的產生[14]。IκBα 作為NF-κB 抑制劑，可以抑制NF-κB活性，使其在RA 滑膜組織中的含量下降。

Bi 等[15]發現梓醇在星形膠質細胞的炎癥反應中可以抑制PTGS2 的產生，使NF-κB 失活可能是其抗炎機制的主要決定因素。Park[16]研究發現，桃葉珊瑚苷能夠抑制細胞外信號調節激酶(ERK)活性、Iκ-Bα 降解和隨后的NF-κB 活化。Wang 等[17]發現桃葉珊瑚苷在大鼠關節軟骨細胞中可以抑制PTGS2 的產生，并且抑制IL-1β 誘導炎癥反應及軟骨基質降解，其作用是通過抑制NF-κB 信號通路活性實現的。Pan 等[18]發現京尼平苷可以促進經IL-1β 刺激的大鼠軟骨細胞中膠原蛋白Ⅱ的表達，增加抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達。

本文以熟地黃環烯醚萜類的5個成分為研究對象，進行靶點預測，采用網絡構建以及通路注釋分析的網絡藥理學方法對熟地黃潛在的抗RA 作用機制進行研究，發現桃葉珊瑚苷和京尼平苷作用的與RA 相關的靶點較多，為熟地黃環烯醚萜類化合物發揮抗RA 活性的關鍵成分；TNF、IL-1β、IL-6、IκBα 是關鍵靶點；由GO 分析和KEGG 通路注釋分析結果可知，熟地黃環烯醚萜成分作用的靶點主要通過炎癥反應、凋亡過程、IL-6 產生的正向調控、NF-κB 轉錄因子活性的正向調控等生物學過程，在NF-κB 信號通路、TLR 信號通路、TNF 信號通路、細胞凋亡中發揮抗RA 活性。本研究闡明熟地黃環烯醚萜類化合物抗RA 的“多成分-多靶點-多通路”作用機制特點，為深入研究熟地黃抗RA 的作用機制奠定了基礎。