肝細胞生長因子及RECK在胃癌組織中的表達及臨床意義

孟寧，周謙，趙靜，劉晟楠，曹云麗

胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，位居全球惡性腫瘤死亡的第二位[1]。由于胃癌發(fā)病具有隱匿性，早期癥狀不典型，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)多處于中晚期，治療手段有限，遠期預后較差。肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)是一種重要的抗纖維化因子，通過自主分泌和旁分泌作用于血管內(nèi)皮細胞，從而發(fā)揮促分裂、趨化及血管構(gòu)造的作用，廣泛參與腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移[2]。Kazal基序富含半胱氨酸的逆轉(zhuǎn)誘導蛋白(reversion inducing cysteine rich protein with Kazal motifs, RECK)是近年來新發(fā)現(xiàn)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)的抑制劑，可在轉(zhuǎn)錄后水平抑制多種MMPs的活性，并進而抑制腫瘤血管生成，從而阻斷腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[3]。本試驗采用免疫組化方法檢測胃癌組織及相應癌旁正常組織中HGF及RECK的表達，分析其與胃癌臨床病理參數(shù)之間的關系，并分析兩者在胃癌組織中表達的相關性，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2013年5月—2016年11月石家莊市人民醫(yī)院普外科確診胃癌患者60例手術標本，分別取其胃癌組織及相應的癌旁正常組織。納入標準：手術病理診斷明確，臨床病理資料完整，術前未行放化療及其他抗腫瘤治療，未合并其他惡性腫瘤或胃癌復發(fā)后再次手術者。其中男50 例，女10 例。年齡47～80歲，中位年齡65.5歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準，患者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 觀察指標與方法 (1)胃癌組織及癌旁正常組織HGF及RECK的表達檢測： HGF及RECK兔抗人單克隆抗體均購自美國Abcam公司，兔SP免疫組化檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。免疫組化采用S-P三步法檢測胃癌組織及相應的癌旁正常組織HGF及RECK。免疫組化分析結(jié)果采用半定量評分系統(tǒng)，由2位病理醫(yī)師分別雙盲閱片：HGF及RECK陽性均定位于細胞質(zhì)。在切片及染色均勻的區(qū)域，選取5個高倍鏡視野 (×100)，按染色細胞數(shù)的百分率及細胞著色強度作為判斷標準。①細胞著色程度判定(染色深淺需與背景著色相對比) ：0分(不著色)，1分(淡黃色)，2分(棕黃色)，3分(棕褐色)；②陽性細胞所占的百分比判定：0分(無陽性細胞表達)，1分(陽性細胞≤10%)，2分(陽性細胞11%～50%)，3分(陽性細胞51%～75%)，4分(陽性細胞>75%)。根據(jù)2項評分之積，≤3分為陰性表達，>3分為陽性表達。(2)收集胃癌患者臨床病理資料。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料用頻數(shù)或率(%)表示，采用χ2檢驗；胃癌HGF和RECK表達之間的相關性采用Spearman相關性分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 胃癌組織及癌旁正常組織中HGF及RECK的表達比較 胃癌組織及癌旁正常組織中HGF陽性表達率分別為80.0% (48/60) 和56.7% (34/60)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。胃癌組織及癌旁正常組織中RECK陽性表達率分別為 58.3% (35/60)和91.7%(55/60) ，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),見表1。HGF和RECK在胃癌及癌旁正常組織中的表達見圖1。

表1 胃癌及癌旁正常組織中HGF和RECK的表達比較 [例(%)]

注：A.胃癌組織HGF表達；B. 癌旁正常組織HGF表達；C.胃癌組織RECK表達；D. 癌旁正常組織RECK表達

2.2 HGF、RECK陽性表達與胃癌患者臨床病理參數(shù)之間的關系 60例胃癌組織中，HGF和RECK均主要定位于腫瘤細胞的細胞質(zhì)。HGF陽性表達與腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(P<0.05)，而與患者性別、年齡、腫瘤直徑、T分期無關(P>0.05)。RECK陽性表達與T分期、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(P<0.05)。而與患者性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤分化程度無關(P>0.05)，見表2。

2.3 胃癌組織中HGF及RECK表達之間的相關性 采用Spearman相關性分析得出，胃癌組織中HGF與RECK陽性表達呈負相關(r=-0.423，P<0.05)。

2.4 胃癌組織中HGF及RECK陽性表達與預后的關系 根據(jù)術后病理HGF及RECK的表達情況，將患者分為HGF陽性亞組(n=48)和HGF陰性亞組(n=12)，RECK陽性亞組(n=35)和RECK陰性亞組(n=25)。HGF陽性亞組術后1年無瘤生存率與HGF陰性亞組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，術后3年無瘤生存率低于HGF陰性亞組(P<0.05)。RECK陽性亞組術后1年無瘤生存率與RECK陰性亞組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，術后3年無瘤生存率與RECK陰性亞組比較雖有一定的生存優(yōu)勢，但差異亦無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。

3 討 論

胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，因早期無典型臨床癥狀，發(fā)現(xiàn)時大多已發(fā)生局部浸潤甚至遠處轉(zhuǎn)移，從而失去了最佳的手術機會，遠期預后較差。HGF最初僅被認為是肝細胞增殖的絲裂原之一，后來發(fā)現(xiàn)其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[4]。HGF主要由間質(zhì)細胞產(chǎn)生，通過自主分泌和旁分泌作用于血管內(nèi)皮細胞，從而發(fā)揮促分裂、趨化及血管構(gòu)造的作用。HGF與其受體c-Met結(jié)合后，可以激活血管內(nèi)皮細胞的增殖，減弱細胞之間的黏附作用，增強細胞運動和遷移，參與腫瘤新生血管的生成，并促進腫瘤的遠處轉(zhuǎn)移[5]。近年來研究表明，HGF、c-Met的過度表達，HGF/c-Met信號通路的激活可能在胃炎到胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，可能成為胃癌的潛在治療靶點[6-8]。本研究發(fā)現(xiàn)，HGF在胃癌組織中的表達顯著高于癌旁正常組織，提示HGF可能參與了胃癌的發(fā)生及演變過程。在胃癌組織中HGF在低分化組的表達明顯高于高—中分化組，在TNM Ⅲ+Ⅳ期組中明顯高于TNMⅠ+Ⅱ期組，且在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示HGF與其受體結(jié)合后啟動了HGF/c-Met信號通路，破壞細胞之間的連接，影響腫瘤細胞間的黏附作用，誘導細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)的降解，通過破壞基底膜和增加蛋白水解來促進腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。Li等[9]的研究表明，HGF/c-Met可以活化β黏連蛋白，在減少細胞間黏附而促進細胞移位過程中發(fā)揮一定作用。Han等[10]的研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中加入HGF處理后的胃癌SUN-16細胞形態(tài)發(fā)生了明顯的改變，同時伴有細胞膜E-cadherin的下調(diào)，表現(xiàn)出了較強的侵襲作用。Sawada等[11]在對卵巢癌細胞的研究中通過RNA干擾技術成功抑制了c-Met的活性，減少了腫瘤細胞對細胞外基質(zhì)的破壞，從而降低了腫瘤細胞的侵襲能力。在對肝癌的研究中，Goyal等[12]提出HGF/c-Met信號通路促進了腫瘤新生淋巴管及新生血管的生成，進而在腫瘤轉(zhuǎn)移方面起到一定作用。此外，還有學者提出HGF/c-Met通過上調(diào)環(huán)氧合酶的基因表達和增加前列腺素的合成，從而影響胃癌的生長和轉(zhuǎn)移[13]。 然而，鑒于腫瘤發(fā)生發(fā)展的復雜性，其具體機制還需進一步研究。

表3 不同HGF及RECK表達情況患者術后1年、3年無瘤生存率比較 [例(%)]

表2 60例胃癌組織中HGF和RECK陽性表達與臨床病理參數(shù)的關系 [例(%)]

RECK基因是1998年Takahashi等在v-Ki-ras轉(zhuǎn)染的細胞株NIH3T3中通過表達克隆的方法分離出來的。RECK可以通過直接抑制酶的活性，調(diào)節(jié)酶從細胞的釋放及對細胞表面的酶阻斷等多種機制，抑制包括MMP-2、MMP-9在內(nèi)的多種MMPs活性[14]。RECK高表達時，MMPs的活性降低到不能使ECM重塑，已有血管發(fā)出的新生毛細血管及產(chǎn)生的新管腔亦被抑制[15]，從而發(fā)揮其抑制新生血管生成的作用。本研究結(jié)果提示，RECK在胃癌組織中的陽性表達率為58.3%，明顯低于癌旁正常組織。RECK的陽性表達與腫瘤T分期、TNM分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(P<0.05)，且隨T分期、TNM分期的提高及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)而降低。RECK與患者的性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤分化程度無關(P>0.05)。Song等[16]在對胃癌組織研究中發(fā)現(xiàn)，RECK的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者的臨床分期呈明顯負相關，這與本研究結(jié)論相似。在三陰乳腺癌組織中，RECK蛋白表達下調(diào)，可減弱對MMP9的抑制作用，從而促進腫瘤細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移，并對患者的預后有一定的預測作用，為臨床治療提供參考[17]。對HGF在胃癌T分期的分析中，發(fā)現(xiàn)其在T1+T2組中的陽性率為66.7%，在T3+T4組中的陽性率為81.5%，差異無明顯統(tǒng)計學意義(P>0.05)，這與谷光福等[18]的研究存在差異，可能因為本研究收治的患者大多為中晚期，早期病例較少，存在樣本選擇性偏移，有待于今后擴大樣本量再做進一步的研究。

根據(jù)術后病理HGF及RECK的表達情況，對患者進行了不同的分組，發(fā)現(xiàn)不同HGF及RECK表達亞組間術后1年無瘤生存率差異不顯著。HGF陽性亞組術后3年無瘤生存率低于HGF陰性亞組，提示術后病理HGF陽性表達的患者，預后多不佳。RECK陽性亞組術后3年無瘤生存率與RECK陰性亞組比較雖有一定的生存優(yōu)勢，但差異無統(tǒng)計學意義，需要擴大樣本量進行進一步的統(tǒng)計研究。相關性分析表明，胃癌組織中HGF與RECK的表達呈明顯的負相關，隨著RECK表達陽性率降低，HGF陽性率顯著升高，從而激活相應的信號通路促進胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，HGF過表達和RECK低表達可能參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展。HGF通過激活HGF/c-Met信號通路加速了細胞外基質(zhì)的降解，從而促進了腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移；RECK通過抑制某些MMPs的活性和新生血管的形成，發(fā)揮其腫瘤抑制基因的作用。術后病理HGF陽性表達的患者，預后多不佳，而術后病理RECK陽性表達的患者，具有一定的生存優(yōu)勢，但無統(tǒng)計學意義。聯(lián)合檢測HGF和RECK為臨床上預測胃癌侵襲轉(zhuǎn)移、預后評估及指導合理的綜合治療等提供了重要的理論依據(jù)。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

孟寧、周謙：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；趙靜：提出研究思路，分析試驗數(shù)據(jù)，論文審核；劉晟楠：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改；曹云麗：進行統(tǒng)計學分析