溫陽散纖湯對博來霉素誘導的肺間質纖維化小鼠肺組織中羥脯氨酸及轉化生長因子-β1含量的影響

朱曉龍 邱念念 狐啟貴

貴州中醫藥大學第一附屬醫院呼吸科，貴州貴陽 550001

特發性肺間質肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種由多種原因引起的慢性纖維化肺疾病，會使患者彌散功能降低、通氣/血流比例失衡，最終心肺衰竭致死[1-3]。近些年研究發現IPF 發病率呈上升趨勢，且致死率高，也無有效的根治措施，因此成為全球共同關注的醫學熱點問題[4-5]。肺移植是目前IPF唯一有效的治療方法，藥物治療雖然能延緩肺功能下降速度，但無法終止病情，因此治療效果尚不樂觀[3]。祖國醫學將IPF 歸為“肺痹”“肺痿”范疇，認為其為本虛標實之證，痰濁、瘀血為其病理因素[6-7]，因此以溫陽為主治療IPF，均取得一定療效[8]。溫陽散纖湯為本課題組臨床經驗方，以往研究顯示此方劑中單藥對肺纖維化具有顯著改善作用[6-7]，但對于復方在肺纖維化中的研究較少，因此本課題組將進一步探討其作用機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

18 只C57BL/6 小鼠購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[動物許可證號：SCXK（湘）2016-0002]，大鼠在25℃室溫下自由飲食和攝水，所有動物實驗已經通過貴州中醫藥大學第一附屬醫院動物倫理委員會通過。

1.2 主要儀器與試劑

小鼠羥脯氨酸（Hyp）酶聯免疫吸附試劑盒（酶免生物技術有限公司，批號：MM-0308M1）；小鼠轉化生長因子-β1（TGF-β1）酶聯免疫吸附試劑盒（酶免生物技術有限公司，批號：MM-0135M1），溫陽散纖湯（廣東一方制藥有限公司，批號：0139573621629）；鹽酸博來霉素（北京索萊寶科技有限公司，批號：801G023）；甲基潑尼松龍（MACKLIN，批號：C10125981）；RT-6100酶標儀（Rayto 公司）。

1.3 實驗分組與處理

將18 只小鼠隨機分為六組，即模型組，溫陽散纖湯低、中、高劑量組，陽性組，正常組，假手術組，每組小鼠3 只。

1.3.1 造模 除正常組及假手術組外，其余幾組小鼠按照如下操作進行造模：小鼠4%水合氯醛麻醉后，取仰臥位固定于操作臺上，頸部剃毛并用碘氟消毒后，沿著頸部正中做1 cm 切口，鈍性分離氣管前組織使氣管暴露，然后迅速向小鼠氣管內注入5 mg/kg 博來霉素0.2～0.3 ml，注射后使小鼠直立并左右旋轉，以使博來霉素在肺組織內均勻分布，最后無菌條件下縫合皮膚。假手術組小鼠以與造模同樣方法向氣管內注入0.3 ml 生理鹽水[9-11]。

1.3.2 模型組處理 灌以等體積的生理鹽水，每日1次，共4 周。

1.3.3 溫陽散纖湯組處理 溫陽散纖湯低、中、高劑量組在造模后第2 天開始每日以5.6625、11.3250、22.6500 mg/（kg·d）小鼠體重灌胃，每日1 次，共4 周。

1.3.4 陽性組處理 以甲基潑尼松龍15 mg/（kg·d）小鼠體重腹腔注射，每日1 次，共4 周。

1.3.5 正常組處理 灌以等體積的生理鹽水，每日1次，共4 周。

1.3.6 假手術處理 灌以等體積的生理鹽水，每日1次，共4 周。

1.4 觀察指標

實驗結束后取小鼠右肺組織用于Hyp 及TGFβ1 含量的測定，嚴格按照HYP、TGF-β1 試劑盒說明書通過酶聯免疫吸附試驗（ELISA）測定Hyp、TGF-β1含量。

1.5 統計學方法

應用SPSS 20.0 統計學軟件進行數據分析，所有實驗重復3 次，計量資料用均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t 檢驗，多組之間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

模型組的Hyp 及TGF-β1 含量高于正常組及假手術組，差異有統計學意義（P＜0.05）；溫陽散纖湯低、中、高劑量組及陽性組的Hyp 及TGF-β1 含量低于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）；溫陽散纖湯中、高劑量組及陽性組的Hyp 及TGF-β1 含量高于溫陽散纖湯低劑量組，差異有統計學意義（P＜0.05）；溫陽散纖湯高劑量組及陽性組的Hyp 及TGF-β1 含量低于溫陽散纖湯中劑量組，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖1～2、表1）。

圖1 各組小鼠肺組織中Hyp 含量測定情況的比較

圖2 各組小鼠肺組織中TGF-β1 含量測定情況的比較

表1 各組小鼠肺組織中Hyp 及TGF-β1 含量測定情況的比較（±s）

表1 各組小鼠肺組織中Hyp 及TGF-β1 含量測定情況的比較（±s）

與正常組比較，*P＜0.05；與假手術組比較，+P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與低劑量組比較，△P＜0.05；與中劑量組比較，□P＜0.05

正常組（n=3）假手術組（n=3）模型組（n=3）溫陽散纖湯低劑量組（n=3）溫陽散纖湯中劑量組（n=3）溫陽散纖湯高劑量組（n=3）陽性組（n=3）F 值P 值2.14±0.21 2.31±0.23 6.06±0.60*+1.63±0.16#2.77±0.27#△2.45±0.21#△□2.00±0.20#△□25.328 0.012 75.64±7.52 73.01±7.30 102.28±10.20*+59.86±5.99#95.69±9.56#△69.98±7.01#△□65.19±6.52#△□18.653 0.005組別 Hyp（μg/ml） TGF-β1（ng/ml）

3 討論

溫陽散纖湯是本課題組的臨床經驗方，以補骨脂、熟地黃、黃精、淫羊藿、黃芪、麥冬為主方，在佐以川芎、丹參、當歸、地龍，諸藥合用，共奏益肺活血、納氣平喘，扶正祛邪之功效[6-7]。同時以往研究顯示此方劑中單藥對肺纖維化具有顯著改善作用，如黃芪水提物可降低肺組織中Hyp 的含量，抑制TGF-β、血管內皮生長因子（VEGF）表達水平，從而改善小鼠肺纖維化的程度[12]。丹參酮ⅡA 通過iNOS 通路調控下游炎癥因子的釋放，從而緩解小鼠肺纖維化[13]。麥冬可抑制肺纖維化大鼠肺組織基質金屬蛋白酶9（MMP-9）和金屬蛋白酶組織抑制因子1（TIMP-1）的合成及分泌，調節兩者的比值，這可能是其抑制肺纖維化形成的機制之一[14]。當歸對大鼠彌漫性肺間質纖維化有明顯的治療作用，與抑制NF-κB 活性及下調TGF-β1表達有關[15]。且本課題前期已經證實此方能顯著的改善IPF 小鼠肺組織病理變化，但具體機制尚未明確，因此本研究將進一步探討溫陽散纖湯對IPF 小鼠改善作用的相關機制。

Hyp 是機體膠原蛋白成分的一種，占膠原蛋白氨基酸總量的13%，而且幾乎所有的Hyp 都存在于膠原蛋白中，因此Hyp 的含量能夠反映組織中膠原的代謝情況，測定肺組織中Hyp 的含量能夠反映膠原的沉積情況，也能夠反映藥物的治療效果[12]。TGF-β 是目前與IPF 纖維化最為密切相關的蛋白之一，是公認的開關性細胞因子，哺乳動物中只存在前3 種亞型，其中TGF-β1 在哺乳動物組織中含量最高，與細胞、組織的纖維化的發生最為密切。TGF-β 通過與其受體（Ⅰ型受體：TβRⅠ，Ⅱ型受體：TβRⅡ，Ⅲ型受體：TβRⅢ）相互結合，將信號傳遞給下游底物Smad 蛋白家族，進而調控上皮-間質轉化、促組織纖維化、促血管生成、促腫瘤的免疫逃逸、抑癌和促癌等多種生理病理過程，因此靶向TGF-β1 及其受體的小分子抑制劑已成為多種疾病如惡性腫瘤及組織纖維化的治療過程[16-18]。同時有研究顯示，Hyp 及TGF-β1 在小鼠肺纖維化中高表達，抑制Hyp 及TGF-β1 表達量的提高對于小鼠肺纖維化的改善具有顯著促進作用[12，19-20]。因此本研究采用ELISA 法檢測溫陽散纖湯對IPF 小鼠肺組織中Hyp 及TGF-β1 含量的影響，結果顯示，與模型組比較，溫陽散纖湯低、中、高劑量組能降低Hyp及TGF-β1 含量，進而改善IPF 小鼠肺組織纖維化。而且ELISA 結果還顯示，溫陽散纖湯中、高劑量組對Hyp 及TGF-β1 含量的抑制作用效果低于低劑量組，溫陽散纖湯高劑量組對Hyp 及TGF-β1 含量的抑制作用效果高于中劑量組，從而提示溫陽散纖湯對IPE 小鼠纖維組織中Hyp 及TGF-β1 含量的抑制作用具有劑量依賴性。以往研究也證實此方單藥中黃芪水提物、當歸、地龍均可通過降低小鼠或大鼠肺組織中Hyp、TGF-β 表達水平，進而改善小鼠肺纖維化的程度[12，20-21]。也間接地證實了溫陽散纖湯對IPF小鼠的改善作用與降低肺組織中Hyp、TGF-β 表達水平有關。

綜上所述，溫陽散纖湯低、中、高劑量能降低IPF小鼠肺組織中Hyp 及TGF-β1 含量，且具有劑量依賴性，從而說明一定劑量范圍的溫陽散纖湯通過降低Hyp、TGF-β 表達水平進而改善IPF 小鼠肺組織纖維化。