交聯質譜技術研究進展

張 潔，劉春麗，李 欣，張 媛，韓碧瑩，趙躍芳

(內蒙古大學 省部共建草原家畜生殖調控與繁育國家重點實驗室，內蒙古 呼和浩特 010070)

蛋白質作為生命功能的“執行者”，在生命體中通過高度復雜且動態變化的相互作用網絡調控各種生物過程，蛋白質相互作用的研究是闡明生物學過程的關鍵。傳統蛋白質相互作用的研究方法主要有酵母雙雜交篩選(Y2H)法、免疫共沉淀(Co-IP)法、親和純化與質譜聯用(AP-MS)法[1]、鄰近依賴性生物素鑒定(BioID)法[2]等，這些方法雖然已經應用到許多生物學研究中，但具體操作仍存在一定的局限性。Y2H法假陽性較高，由于融合蛋白受表達條件限制，可能導致蛋白質的修飾與折疊發生改變，不能形成正確的相互作用關系； Co-IP法與AP-MS法靈敏度較低，無法捕捉瞬時與低親和力的相互作用蛋白，且不能區分作用方式[3]；BioID法可用于蛋白質相互作用的篩選，但由于需要添加過量生物素，可能對細胞產生毒害作用，而且生物素化會改變蛋白的電荷與修飾，影響鄰近蛋白的行為。

交聯質譜技術(XL-MS)是將蛋白質化學交聯技術與質譜技術相結合，用于研究蛋白質結構以及蛋白質相互作用的新方法。通過在樣品中加入適量的小分子化學交聯劑，使空間足夠接近的氨基酸與交聯劑發生共價連接，從而將已經發生的相互作用穩定下來，通過質譜與交聯質譜數據處理軟件解析確定發生相互作用的蛋白質以及具體作用的交聯位點，獲取蛋白質相互作用信息，結合交聯劑的長度對蛋白質的空間結構及蛋白質復合體亞基的空間排列進行預判[1]。

XL-MS的優勢[4]在于：(1)樣品制備簡單。蛋白質發生交聯后經過常規蛋白質組學的酶切、純化、質譜分析便可得到交聯信息，操作簡便，不受分子量以及樣品純度限制；(2)檢測通量高。基于質譜技術特點，可以高通量地同時進行多種蛋白質的結構和相互作用的分析；(3)靈敏度高。生物反應轉瞬即逝，交聯劑可以使瞬時相互作用和結合不牢固的反應的特定氨基酸發生共價連接，揭示瞬時或者微弱的蛋白質相互作用；(4)作用方式明確。XL-MS可確定蛋白質之間是直接相互作用還是間接相互作用，結合晶體結構信息可以明確相互作用界面信息；(5)應用范圍廣。交聯劑除了可以在蛋白分子水平上交聯，部分交聯劑還可進入細胞內交聯，在細胞水平上實現生理狀態的相互作用研究。

1 交聯質譜技術的工作流程

XL-MS的工作流程(圖1)包括：蛋白質交聯反應的進行(體外純化蛋白質復合物交聯、親和純化蛋白質交聯、體內交聯)；交聯蛋白質或肽段的富集純化；交聯蛋白質的酶切；交聯多肽的質譜鑒定；質譜數據的解析與交聯位點的確定，結合已有的蛋白質結構信息進行復合體結構模型建立，蛋白質相互作用網絡分析和亞基拓撲圖譜分析。

圖1 XL-MS的工作流程

蛋白質交聯反應是XL-MS分析的關鍵步驟之一，直接影響著實驗結果的成敗。在研究簡單蛋白質或蛋白質復合體亞基的相互作用界面時，要預先根據目的蛋白的結構及感興趣的結構域選擇合適的交聯劑，在不影響蛋白質正常構象且交聯劑反應活性較高的條件下進行交聯，通過確定交聯劑與目的蛋白反應比例、反應酸堿度與反應時間等，使交聯劑與蛋白質和緩沖液體系相匹配，避免破壞蛋白質天然結構而引起交聯反應過度或不足，出現少交聯或假交聯的錯誤信息[4]；在研究未知蛋白質相互作用時，交聯劑中間臂的長度也是重要影響因素。

酶切反應通常選用常規的胰蛋白酶(trpsin)切割精氨酸(Arg)和賴氨酸(Lys)的C端。Leitner等[5]研究發現，除了使用胰蛋白酶外，添加4種蛋白酶天冬氨酸(Asp)-N、谷氨酸(Glu)-C、Lys-C和Lys-N等多酶酶切可以增加交聯位點的鑒定數。

交聯肽段的特異性富集和分離，可以提高交聯肽段的信號強度并降低樣品的復雜性，提高交聯肽段的鑒定效率，根據富集時間的不同分為消化前蛋白質富集和消化后肽段富集。消化前蛋白質富集指對感興趣的細胞器或目標蛋白質進行提純或靶向富集，即將交聯與親和純化相結合，通過親和純化釣取交聯反應后目標蛋白質復合物或先釣取目標蛋白質復合物再進行交聯反應，可以有效降低交聯肽段鑒定的復雜性[6]。交聯蛋白也可通過SDS-PAGE膠內分離與酶解。在質譜數據采集時，可以通過設定二級質譜條件采集，只采集高價態離子的二級質譜信息，提高交聯肽段的鑒定率[7]。消化后肽段富集指將發生交聯的肽段與非交聯的線性肽進行分離，常用的方法是尺寸排阻色譜法(size exclusion chromatography,SEC)。Leitner等[5]使用SEC分析，基于其較高的分子量選擇交聯線性肽段，從而減少了存在于交聯體系中大多數非交聯的線性肽，證明SEC是一種有效的交聯肽段富集方法。此外，由于交聯肽段的電荷數增加，交聯肽段比線性肽擁有更多的帶正電荷的堿性氨基酸，可使用強陽離子交換色譜法(strong cation exchange chromatography,SCX)進行富集分離[8]。

2 交聯質譜技術的主要應用

2.1 蛋白質結構的研究

蛋白質結構研究的常規方法有：X-射線晶體衍射法、核磁共振波譜法等。雖然這些方法具有精密度高、獲得信息豐富等優點，但對于蛋白質樣品的純度、濃度、分子大小及可結晶性等要求很苛刻，不利于對大分子蛋白質復合體結構的解析。而XL-MS在這一方面起到不可或缺的作用，當電鏡的分辨率不夠或蛋白難以形成結晶時，可通過XL-MS結果解析出蛋白質不同結構域或不同亞基之間的相互作用界面[9]。通過軟件預測出多種可能構象后，XL-MS數據可以輔助排除一些不合理的構象[10]。XL-MS以其獨特優勢，與低溫冷凍電子顯微鏡(cryo-EM)、X-射線晶體衍射法等其它研究蛋白質結構的方法相結合，在超大分子量蛋白質復合體結構的解析中起到了提供距離約束、指導計算模型確定亞結構作用位點的重要作用，體現了其在蛋白質結構研究中的實用性和重要性[1]。

核糖體蛋白S1由于其動態的特征，無法通過X-射線晶體衍射技術進行觀察。2011年，Lauber等[11]通過新型的賴氨酸反應性交聯劑(亞乙基次硫亞氨酸二乙酯,DEST)，利用XL-MS探測柔性組件中亞基間作用關系的特性，成功定位了大腸桿菌核糖體復合物上核糖體蛋白S1的結合位點[12]。蛋白酶體26S由調控亞基19S和催化亞基20S組成，20S的結構早在1995年通過X-射線晶體衍射技術完成了解析[13]，但完整的26S復合體由于其溶解性差、結晶困難未能獲得結構信息。2012年，Lasker等[14]通過XL-MS、EM及其它方法的聯合使用獲得了蛋白酶體26S的完整結構。2014年，Erzberger等[15]將XL-MS、EM、X-射線晶體衍射技術以及綜合建模相結合，闡明了釀酒酵母的40S核糖體·eIF1·eIF3復合物的結構，共鑒定到965對蛋白內和蛋白間的交聯。線粒體的核糖體在結構和細胞功能上與胞質核糖體差異很大，主要負責合成一定數量的疏水膜蛋白，晶體培養難度大限制了X-射線晶體衍射技術對其結構的解析，在高分辨率cryo-EM研究線粒體核糖體結構的研究中，XL-MS對復合體中單個亞基的定位起到了關鍵作用[16]。2015年，Martinez-Rucobo等[17]通過XL-MS成功解析了體外重組的加帽酶(capping enzyme,CE)與磷酸化的RNA聚合酶Ⅱ(PolⅡp)形成的轉錄復合體PolⅡp-CE的結構，共獲得527個交聯肽段，其中337個符合賴氨酸-賴氨酸交聯的距離限制。此項研究再次證實了XL-MS是研究動態柔性蛋白質復合體的有效方法。此外，XL-MS還成功地用于解析TriC/CCT伴侶蛋白系統[18]、核孔復合物[19]、CRISPR-Cas復合物[20]以及PolⅡ-介體起始復合物[21]的結構。

2.2 蛋白質相互作用的鑒定

由于AP-MS法與Co-IP法研究蛋白質相互作用存在局限性，可將其與XL-MS結合，在親和純化或免疫共沉淀之前進行共價交聯，就可以順利將瞬時或微弱的蛋白質相互作用固定下來，并且通過交聯位點的解析獲得相互作用的空間界面信息。2012年，Herzog等[22]通過對蛋白質磷酸酶2A(PP2A)信號通路檢測到的已知蛋白質進行親和標記純化后在磁珠上進行交聯，經質譜分析鑒定到涉及特定三聚體PP2A復合物與許多銜接子蛋白之間相互作用的176個蛋白間和570個蛋白內交聯，并闡明了免疫球蛋白結合蛋白1(IGBP1)和PP2A之間的結合界面，揭示了TCP1環復合物(TRiC)伴侶蛋白與PP2A調節亞基2ABG相互作用的拓撲結構。2015年，Shi等[23]利用免疫共沉淀結合XL-MS，使用工程設計的GFP納米抗體從細胞中親和捕獲GFP標記的蛋白質復合物，然后直接在磁珠上進行交聯反應，將交聯結果結合計算機模擬解析了多個蛋白質復合物的天然結構。

除此之外，XL-MS也可以單獨應用于細胞環境(活細胞或細胞裂解液)中研究生理狀態下蛋白質的相互作用，捕獲生理條件下廣譜的瞬時、微弱的蛋白質相互作用。目前XL-MS已經用于幾種不同生物全蛋白質組范疇的相互作用研究。2012年，Yang等[24]通過在大腸桿菌和線蟲的裂解液中進行交聯，使用pLink軟件分別鑒定到394對和39對交聯肽對，之后開發了一種類似BS3的以賴氨酸為靶標的可富集的交聯劑，在大腸桿菌裂解液中得到3 130個相互作用的賴氨酸肽對，屬于677個蛋白質；在線蟲裂解液中鑒定到893個相互作用賴氨酸肽對，屬于121個蛋白質[25]。2015年，Liu等[26]在HeLa細胞裂解液中利用二琥珀酰亞胺基亞砜(DSSO)交聯后鑒定到2 179個獨特的賴氨酸-賴氨酸交聯肽段，并闡述了80S核糖體核心復合體與纖溶酶原激活物抑制劑 RNA結合蛋白1(SERBP1)之間的相互作用結構細節；2017年，他們在大腸桿菌和HeLa細胞裂解液中進行全蛋白質組范圍的相互作用研究，對質譜碎裂方法以及數據分析方法進行優化后，分別鑒定到1 158對和3 301對交聯肽對，并重點描述了涉及翻譯、蛋白質折疊和碳水化合物代謝的幾種蛋白質復合物的結構信息，這些蛋白質相互作用網絡為許多內源性大分子復合體結構及相互作用研究提供了重要信息[27]。2018年，Fasci等[28]利用XL-MS繪制了人源細胞核中的蛋白質相互作用圖，在確定的8 700個交聯肽段的2/3代表不同蛋白質間的相互作用，并重點闡述了核小體上核心組蛋白的相互作用，建立了USF3和Ran GTPase與核小體結合模式的低分辨率模型。諸多的研究證實XL-MS在復雜樣品中有著較好的應用，設法在體內(細胞內)進行交聯可以在蛋白質復合物保持天然構象且不會破壞翻譯后修飾的生理條件下研究蛋白質相互作用。

3 交聯質譜技術應用的主要挑戰

交聯劑、交聯肽段的富集以及反應位點具有特異性、交聯肽段豐度低、交聯肽段譜圖復雜、解析困難等諸多因素限制了XL-MS的發展。XL-MS中應用最廣泛的交聯劑是基于N-羥基琥珀酰亞胺酯類(NHS)的胺基交聯劑，但NHS易發生水解，而且當蛋白質缺乏賴氨酸(如膜蛋白的跨膜區域賴氨酸較少)時，胺基交聯劑則無法捕捉相互作用蛋白。雖然研究開發了許多靶向其它氨基酸的新型交聯劑，但在具體應用時仍會受到一定限制。此外，全蛋白質組范疇的蛋白質交聯質譜研究對于交聯肽段的富集純化以及交聯肽段譜圖的解析提出了更大的挑戰，交聯蛋白濃度通常很低，有效的富集分離是交聯質譜鑒定的關鍵。而產生的交聯肽段極大地增加了譜圖解析的復雜度，目前可用的軟件工具中，都有其特殊性及一定的適用范圍，還沒有十分理想的通用軟件，交聯位點鑒定的可靠性與覆蓋率仍需不斷提升。

3.1 交聯劑

為捕捉與穩定蛋白質間的相互作用可利用反應活性較高的側鏈基團，如賴氨酸上的氨基、天冬氨酸和谷氨酸上的羧基、精氨酸上的胍基、半胱氨酸上的巰基，分別設計開發氨基反應的交聯劑、羧基反應的交聯劑、胍基反應的交聯劑以及巰基反應的交聯劑，同時可以將這些化學交聯劑不斷優化，使交聯劑具有可進行化學切割、質譜切割或可富集、含標記等不同特性。各種類型的交聯劑簡單介紹如下：

(1) 氨基反應的交聯劑。目前最常用的氨基反應交聯劑是NHS與亞氨酸酯。根據實驗不同，可選擇短臂或長臂、可解離或不可解離、膜通透型或細胞表面型等多種間隔臂類型的NHS，在弱堿性條件下能夠與伯胺反應生成酰胺鍵，具有較高的反應效率，但反應導致的電荷變化可能引起蛋白質構象變化；亞氨酸酯與NHS不同的是它與氨基反應生成堿性脒基，保持了反應位點的正電荷性質，雖然反應效率略低，但特異性高于NHS，水溶性更好。

(2)羧基反應的交聯劑。設計開發蛋白質酸性氨基酸的羧基反應基團的交聯劑能夠擴大XL-MS的應用范圍，與羧基反應的常見化學基團主要有碳化二亞胺(EDC)、重氮烷和羰二咪唑。EDC在酸性條件下具有較高的反應活性，ADH和PDH能夠實現生理條件(pH 值7.0～7.5)下的交聯。目前羧基反應交聯劑的最大缺陷是破壞了蛋白質本身構象，因此在維持蛋白質構象的情況下完成交聯是未來羧基反應交聯劑的優化方向。

(3)胍基反應的交聯劑。精氨酸作為蛋白質中較為豐富的氨基酸之一，大量存在于蛋白質相互作用區域，特異靶向精氨酸胍基的交聯劑主要有以乙二醛為反應基團的PDG與BDG，這類交聯劑的不足是生成較多不穩定產物，質譜信號分散，檢測較為困難[29]。

(4)巰基反應的交聯劑。由于馬來酰亞胺具有與巰基極高的反應活性，可基于馬來酰亞胺設計巰基特異性反應的交聯劑，反應時蛋白質中的游離巰基與交聯劑的雙鍵發生烷化反應生成穩定的硫醚鍵，但這類交聯劑易發生水解，且對pH值較為敏感，pH值越大越易發生水解[30]，可利用它的pH值敏感性，將交聯應用到藥物與蛋白載體的連接，起到藥物在體內定量/定位釋放。另外，基于馬來酰亞胺和酰肼反應基團的交聯劑可適用于連接巰基和糖類，并形成共價交聯。

(5)化學切割交聯劑。化學切割交聯劑是在交聯劑連接臂上設計特殊的化學鍵，化學鍵可在一定條件下發生斷裂，如DSP、DTSSP交聯劑連接臂上的二硫鍵在還原劑作用下斷開，分別采集還原前和還原后樣品的質譜數據，通過比對還原前后的譜圖確定交聯肽段。缺點在于還原后得到的兩條切割肽段可能無法全部鑒定到，導致交聯信息不準確，而且要求體系中不能含與二硫鍵反應的基團，如自由的巰基等。

(6)質譜切割交聯劑。相比于化學切割交聯劑，質譜切割交聯劑則是在連接臂上設計低能量化學鍵，如與苯基相連的肽鍵、固定電荷的硫離子、亞砜和尿素連接的丁酸酯等，這些低能量化學鍵在二級質譜碎裂時會優先斷開實現交聯肽對的分離[28]。商品化的DSSO是目前應用較為廣泛的一類質譜切割交聯劑，它與DSS和BS3具有類似的反應活性，結構簡單，兩側的NHS酯基團可與氨基反應，特殊設計在于中間的連接臂插入了亞砜基團，使得兩側對稱的C-S鍵在質譜中優先發生斷裂。在二級質譜譜圖(MS2)中，DSSO的質譜切割產生特征性譜峰，可根據譜峰識別出交聯肽對，再利用三級質譜譜圖(MS3)結合搜索引擎進行肽測序得到交聯肽段序列。另一種使用較多的質譜切割交聯劑是protein interaction reporter(PIR)，最早于2005年開發設計，其關鍵點在于在交聯劑中引入不穩定的鍵，通過質譜的CID、ECD、IRMPD或其它解離機制使交聯劑的兩個可切割位點原位解離，生成兩條肽段與一個報告基團，且切割生成肽段產生的殘留基團是常見的修飾，便于檢索。根據報告離子與交聯肽段的比例關系，識別交聯肽段提高鑒定準確性。Hage等[31]引入質譜可切割的“零長度”交聯劑：1,1′-羰基二咪唑(CDI)，連接蛋白質中的伯胺和羥基基團，其中間臂長度為短羰基單元(～2.6 ?),可以在生理條件(pH 值7.2～8.0)下進行交聯反應。質譜切割交聯劑簡化了蛋白質結構和復雜相互作用的質譜分析，但也存在三級質譜信號強度下降、譜圖難以解析的問題。

(7)功能交聯劑。可富集的交聯劑、同位素標記的交聯劑、熒光標記的交聯劑、化學選擇性連接交聯劑以及光反應交聯劑等具有特殊功能的交聯劑是基于上述交聯劑衍生而來的。例如,在交聯劑中引入如生物素的可富集基團，使交聯肽段檢測相對量提高，增加實驗結果真實性，甚至在可富集基團設計化學切割位點，實現交聯肽段富集后將富集標簽去除，減少標簽對質譜分析的影響。光反應交聯劑主要是利用芳香疊氮、雙丫丙啶和其它光反應基團而設計的異型雙功能交聯劑，可通過兩步活化使受體-配體相互作用復合體相關的蛋白、核酸和其它分子發生連接。目前，具有各種特殊功能的交聯劑層出不窮，極大地拓展了XL-MS的應用前景，除了用于蛋白質相互作用研究，交聯作為一種生物偶聯的方式也拓展到了核酸、藥物和固相載體表面的修飾。

表1列出了目前常用的部分交聯劑。

3.2 質譜數據采集以及譜圖解析

由于交聯產物兩條肽段的結合使搜索空間呈指數級擴大、統計復雜性以及假陽性增加，交聯肽段的解析鑒定是XL-MS面臨的最大挑戰。早期質譜解析是人工對一級質譜譜圖(MS1)進行解析：在MS1中找到與理論交聯肽段質量相匹配的譜峰，確定其存在，再在MS2的基礎上尋找交聯位點信息。依據該原理開發的數據解析鑒定軟件主要有MS2Links[45]、Links[46]、ProteinXXX[47]、NIH-XL[48]、VIRTUALMSLAB[49]、CLPM[50]、GPMAW[51]、CrossSearch[51]等。但人工解析對MS1的鑒定適用范圍小，尤其是當樣品復雜時，檢索難度急劇上升，很難排除背景噪音、非特異酶切和漏切等因素的影響。

隨著質譜技術以及解析軟件的快速發展，MS2與MS3的解析鑒定優勢逐漸呈示出來，實現了母離子和碎片離子的質荷比信息的同時利用。基于不同化學交聯劑(特殊標記、可裂解/不可裂解)引起的交聯肽段不同的譜圖特點，研究人員針對化學交聯劑的特性開發了與之相匹配的數據庫搜索引擎，使得交聯肽段的譜圖信息更加完整，鑒定結果更加可靠。早期出現的針對特殊標記交聯劑的搜索引擎：Pro-crossLink[52]、CTUX[53]、Xlink-Identifier[54]、XLink[55]、X!Link[56]、FINDX[57]等可用于簡單樣品的分析。針對不可裂解的交聯劑解析的搜索引擎：xQuest[58]、pLink[24]、pLink 2[59]、Kojak[60]、XiSearch[61]、Protein Prospector[62]和StavroX[63]等均可對大型數據庫進行檢索。xQuest利用輕重同位素標記的特殊交聯劑，第一次嘗試了大型數據庫搜索。pLink通過對交聯肽段碎片離子的特點分析，有效利用內部離子、交聯劑斷裂離子等的特殊性，提高了交聯譜圖鑒定率。與需要同位素標記樣品的xQuest 相比，pLink可解析無同位素標記和使用特殊交聯劑交聯的肽段，從而能得到更廣泛的應用。pLink 2是一種在蛋白質組規模上準確性和靈敏度更高的搜索引擎，采用兩個階段的開放式搜索策略，將交聯肽段看作是一條肽段帶有一個未知的修飾，首先通過嚴格的片段索引，根據得分情況確定一條肽，再利用這條肽段的部分碎片離子進行常規數據搜索。Kojak算法集成了傳統數據庫搜索算法采用的譜圖處理和評分方法，并且可以使用許多不同的帶有或沒有同位素標記的化學交聯劑，可用于分析新的和已有的數據集。XiSearch是針對交聯劑BS3的無標記和同位素標記設計的搜索引擎，可使用Skyline軟件進行自動化定量，已應用于多種純化的蛋白質復合物結構分析。此外，Protein Prospector和StavroX均可對復雜的交聯數據集進行檢索，Protein Prospector軟件可用于分析不可裂解交聯劑辛二酸二琥珀酰亞胺酯(DSS)產生的交聯肽段；StavroX可以在網頁上直接進行運算，使用非概率參數來確定交聯候選者的得分，可在短時間內解析交聯數據。

表1 常用的部分交聯劑

續表1

針對可裂解交聯劑的解析方法得益于在MS/MS譜圖中可觀察到的特定交聯報告離子，利用這些報告離子將搜索空間縮小為少數交聯肽的組合，目前可裂解交聯劑DSBU與DSSO的常用搜索引擎分別為MeroX[64]和XlinkX。MeroX應用于MS可裂解交聯劑，擴展了RISEUP和全蛋白質組模式的兩種新型算法，可以實現從單個蛋白到全蛋白質組的XL-MS數據分析，它允許在MS和MS/MS兩個級別進行質量重新校準，減少了質量匹配和總體計算時間的要求，同時增加了交聯肽段鑒定的數量與可靠性。XlinkX 1.0算法首先通過識別所有特征離子峰并找到兩個交聯肽中每個肽的質量，然后進行基于片段的標準搜索以確定其序列，由于嚴重依賴于高質量的CID-MS2譜圖，研究人員不得不使用復雜的高能碎裂方法進行優化，最大程度識別到特征離子峰。XlinkX v2.0[27]大幅提高了解析蛋白質交聯的深度和準確性，它支持MS2-MS3組合的碎裂方法，當MS2裂解交聯共價鍵時，MS3同時將每個交聯肽進行裂解，這樣就可以在兩個水平上提供獨特的序列特異性碎片離子，利用這種多樣化碎裂優勢，XlinkX v2.0可以實現對交聯肽段的更全面準確的解析。但這種方法的局限性在于仍需要高強度的特征離子，導致相似鍵強度的交聯劑很難使用該方法區分，影響使用范圍。此外，與可碎裂交聯劑PIR相匹配的X-links軟件[65]和Blinks軟件[66]也是常用的檢索軟件，但它們的缺點主要是MS3時間較長且信號較低，較難捕獲解析。

MaXLinker[67]是一種以“MS3為中心”的新型搜索算法，較MS2 有更高的鑒定置信度。雖然XlinkX v2.0、X-Links與Blinks也可進行MS3碎裂分析，但它們基于MS3的交聯肽鑒定率與置信度均非常低，MaXLinker基于MS3的算法不僅可以大幅降低錯誤率，而且提高了交聯肽的鑒定率，具有出色的靈敏度和特異性。MetaMorpheusXL[68]是MetaMorpheus軟件中一個新的搜索模塊，可用于鑒定解析MS可裂解和不可裂解的交聯肽。它無需識別交聯肽的特征離子，可通過離子索引算法識別MS可裂解的交聯肽，從而進行有效的大型數據庫搜索。

交聯鑒定結果可以通過可視化展示及網絡圖繪制獲得直觀分析[28]。最直接的可視化方法是在蛋白質三維結構上直接映射鑒定到的交聯位點，但隨著鑒定數據的增加，可視化元素和初始輸入數據之間沒有直接關聯，難以檢測數據的有效性，為此研究人員開發了許多網絡實時可視化的分析軟件。Xwalk[69]是一種在已有的晶體結構的交聯位點進行模擬計算的軟件，通過理論分析交聯劑分子性質獲得一個較為合理的“溶劑可及表面距離”，計算并顯示蛋白質表面化學交聯氨基酸之間的曲面距離。XLink-DB[70]是第一個允許編譯和分析大規模交聯數據的數據庫，不僅可以存儲、共享和處理交聯數據，將交聯數據自動映射到PDB結構，使數據可視化并預測蛋白質相互作用，也可將定量蛋白質組數據添加到現有的蛋白質相互作用數據庫并進行比較，生成蛋白質相互作用網絡，還可以進行物種水平的相互作用分析。Xlink Analyzer[71]是一種在三維結構中分析和使交聯數據可視化的工具，通過自動分析交聯數據，根據置信度得分與交聯類型對數據進行過濾，計算并排除不符合空間約束的交聯，繪制蛋白質表面的化學修飾，并且可以將交聯映射到同聚寡聚體以及潛在的相互作用位點，與常用的結構顯示與建模軟件UCSF Chimera交互式綜合分析擬合到EM圖，獲得蛋白質復合物結構的低分辨率模型。xVis[72]能夠以圓形、條形圖或網絡圖的形式顯示交聯位點及距離，可直觀描繪出蛋白質區域的空間鄰近性以及氨基酸的進化保守性，并根據交聯密度排列和分組聚類算法，確定復合物的近端與遠端亞基InterPro，利用現有的原位庫將輕量級技術和高級數據模型進行整合，最大程度地減少資源浪費[73]。還可根據鑒定分數或錯誤率篩選交聯數據，并顯示每條交聯肽段相應的碎片離子譜圖。xiNET[74]則將視圖顯示更加直接明確，將交聯質譜得到的結果顯示為節點圖，代表蛋白質之間的相互關系，繪制形成蛋白質相互作用網絡。ProXL[75]是一個網頁版的應用軟件，數據易于共享和導入，支持穩定同位素標記的交聯肽段鑒定，可進行精確的質量控制及新穎的可視化分析。Cross-ID[76]不需要文件格式轉換，可以直接鏈接到Proteome Discoverer的XlinkX的輸出文件，還可以與其它平臺聯用實現GO富集分析、翻譯后修飾(PTM)可視化、域和二級結構映射、數據集比較等功能分析，通過DisVis在線平臺(http://milou.science.uu.nl/cgi/ services/ DISVIS /disvis/)對具有已知結構的蛋白質和復合物或蛋白質復合物進行檢測到的交聯驗證。

4 展望

XL-MS的興起是傳統化學交聯方法與現代蛋白質質譜技術相結合發展的結果，對蛋白質復合物結構解析以及蛋白質相互作用研究具有重要作用，“結構決定性質”，了解蛋白質的性質與所承擔的功能對生命科學的發展至關重要。但是目前XL-MS的應用仍受到交聯劑反應位點具有特異性、交聯肽段豐度低、交聯肽段譜圖復雜、解析困難等諸多因素的限制。新交聯劑的設計合成、交聯肽段富集分離方法的建立以及交聯肽段譜圖解析鑒定算法的開發是XL-MS發展的方向。