咪唑立賓結晶工藝研究

程曜峰，冷 鳳，孫丙林，張 煒*，張雪霞*

(1.華北制藥集團新藥研究開發有限責任公司 微生物藥物國家工程研究中心 河北省工業微生物代謝工程技術研究中心，河北 石家莊 050015； 2.華北制藥集團華勝有限責任公司，河北 石家莊 050015)

咪唑立賓(Mizoribine，MZR)，商品名為布累迪寧，是1971年從真菌Eupenicilliumbrefedianum的培養液中分離得到的一種咪唑類核苷[1]，其分子式為C9H13N3O6，化學名為5-羥基-1-β-D-呋喃糖基-1H咪唑-4-羧酸胺，呈白色或微帶黃色的結晶粉末[2]。咪唑立賓早期作為抗真菌藥物開發，后期研究發現其具有免疫抑制效應和抗腫瘤作用[3]。咪唑立賓作為兼抗腫瘤和抗排斥雙重特性的免疫抑制劑，臨床多應用于腎移植術后患者的治療，在降低排斥反應發生的同時，預防、治療腎移植術后惡性腫瘤，從而提高腎移植術后患者的長期存活率[4]。相比于其它免疫抑制劑，咪唑立賓還具有骨髓抑制作用弱、消化系統不良反應小等優點[5]。此外，咪唑立賓臨床上也可用于治療狼瘡性腎炎、類風濕性關節炎[6]及腎病綜合征[7]等自身免疫性疾病。

咪唑立賓主要通過發酵法生產，其發酵產物經過濾、提取、精制、脫色、結晶等過程得到產品。傳統的生產工藝所得產品多為咪唑立賓一水合物，該化合物性質不穩定，不便于儲存和運輸。為提高咪唑立賓的穩定性，專利[8]公開了一種將咪唑立賓一水合物加入到乙醇中加熱回流制備無水咪唑立賓的方法，所得無水咪唑立賓的性質穩定。但該方法所得產品晶粒細小，制劑分裝困難，不利于工業生產。鑒于此，作者對咪唑立賓的結晶工藝進行優化，探究抗溶劑種類、溶液初始濃度、抗溶劑滴加速度及抗溶劑加量對咪唑立賓結晶純度、堆密度、收率和產品穩定性的影響。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

咪唑立賓粗品(純度85%)，華北制藥集團華勝有限責任公司；甲醇、乙醇、丙酮，分析純，天津科密歐化學試劑有限公司；其它試劑均為國產分析純。

高效液相色譜儀(SPD-M20A 型紫外檢測器，LC-20AT型泵，SIL-20A型自動進樣器，CTO-10AS型柱溫箱)，日本Shimadzu公司；OptiMax 1001型結晶器(反應釜 500 mL)， Mettler-Toledo公司；Leica DM500-ICC50型顯微鏡。

1.2 方法

將咪唑立賓粗品溶解于一定體積、一定溫度的純化水中制成溶液，以不同滴加速度加入一定量抗溶劑，抗溶劑加量為水溶液體積的8～12倍；加料結束后養晶3～6 h，過濾，用抗溶劑洗滌濾餅，干燥，即得咪唑立賓結晶產品。

對咪唑立賓結晶過程中抗溶劑種類、溶液初始濃度、抗溶劑滴加速度及抗溶劑加量進行優化，以提高咪唑立賓結晶純度、堆密度和收率。

2 結果與討論

2.1 結晶工藝優化

2.1.1 抗溶劑種類選擇

配制濃度為0.5 g·mL-1的咪唑立賓水溶液，分別以甲醇、乙醇、丙酮為抗溶劑進行結晶，抗溶劑加量為咪唑立賓水溶液體積的10倍，滴加速度為6 BV·h-1，滴加完畢后養晶4 h，考察抗溶劑種類對結晶效果的影響，結果見表1。

表1 抗溶劑種類對結晶效果的影響

由表1可知，使用3種抗溶劑均可以得到結晶產品。綜合考慮，以乙醇為抗溶劑時，結晶產品可獲得更好的純度、堆密度和收率。

2.1.2 溶液初始濃度和抗溶劑滴加速度選擇

在結晶過程中，抗溶劑加量過大會形成超過飽和微環境，容易引發爆發成核，致使晶體細小、晶體團聚、溶劑和雜質包容在晶簇中，從而影響產品質量。降低體系初始濃度可以降低局部的過飽和度，減少爆發成核帶來的負面影響；而過低的初始濃度不僅會增大抗溶劑的消耗量，也會導致收率下降。因此，尋找恰當的初始濃度是控制抗溶劑結晶過程的關鍵之一。

抗溶劑與結晶液的快速混合有利于迅速降低局部的過飽和度，減少爆發成核的發生率。在結晶設備參數固定的情況下，抗溶劑滴加速度是影響溶劑混合的關鍵。對溶液初始濃度和抗溶劑滴加速度兩個參數組合進行優化，結果見表2。

表2 溶液初始濃度和抗溶劑滴加速度對結晶效果的影響

由表2可知，溶液初始濃度高、抗溶劑滴加速度快時收率較高，但純度和堆密度呈下降的趨勢。咪唑立賓產品質量要求純度盡量高，堆密度盡量大。從生產成本控制方面考慮，收率應盡量高一些。綜合考慮，在滿足質量指標要求的前提下，選擇溶液初始濃度為0.7 g·mL-1，抗溶劑滴加速度為5 BV·h-1。

2.1.3 抗溶劑加量選擇

在溶液初始濃度為0.7 g·mL-1、抗溶劑滴加速度為5 BV·h-1的條件下，分別采用8 BV、10 BV、12 BV的抗溶劑加量進行結晶實驗，結果見表3。

表3 抗溶劑加量對結晶效果的影響

由表3可知，抗溶劑加量主要影響產品收率，對純度和堆密度影響較小。綜合考慮原材料的成本與產品收率，選擇抗溶劑加量為12 BV最為經濟。

2.2 優化工藝放大驗證

在優化工藝條件下進行了3批工業規模的生產工藝驗證。稱取14 kg咪唑立賓粗品溶解于20 L純化水中，配制濃度為0.7 g·mL-1的咪唑立賓水溶液。以工業乙醇為抗溶劑，抗溶劑加量為咪唑立賓水溶液體積的12倍，滴加速度為5 BV·h-1，滴加完畢后養晶4 h，過濾、洗滌、干燥得咪唑立賓結晶產品，結果見表4。

表4 咪唑立賓結晶工藝驗證結果

生產工藝驗證所得咪唑立賓晶體與重結晶前咪唑立賓晶體相比，晶體外觀發生明顯變化，由重結晶前的塊狀晶體變為針狀晶體(圖1)。

圖1 咪唑立賓重結晶前(a)后(b)晶體的顯微照片

最佳工藝條件下生產放大所得結晶產品的室溫長期穩定性檢測結果見表5。

表5 室溫長期穩定性檢測結果

由表5可知，生產放大所得結晶產品室溫存放36個月，純度仍達到99.6%，僅下降0.2%，表明結晶產品可長期存放，穩定性好。

優化的咪唑立賓粗品結晶工藝操作簡單、結晶收率高，所制備的產品純度高、堆密度較大、穩定性好，可滿足制劑工藝要求。

3 結論

對咪唑立賓的結晶工藝進行優化，探究了抗溶劑種類、溶液初始濃度、抗溶劑滴加速度及抗溶劑加量對咪唑立賓結晶純度、堆密度、收率和產品穩定性的影響。確定最佳結晶工藝為：以乙醇為抗溶劑、溶液初始濃度0.7 g·mL-1、抗溶劑滴加速度5 BV·h-1、抗溶劑加量為咪唑立賓水溶液體積的12倍(12 BV)。該結晶工藝所得產品純度高、雜質少、堆密度較大、穩定性好，適合工業化生產，有利于長期儲存和制劑分裝，對此類藥品的工業結晶有較好的應用價值。