消渴健脾膠囊中梔子苷的提取工藝優化

朱曉東，張佳佳，王 瑩，蘭 衛

(1.新疆醫科大學烏魯木齊市中醫醫院，新疆 烏魯木齊830011；2.新疆醫科大學附屬中醫醫院， 新疆 烏魯木齊 830002；3.新疆醫科大學中醫學院，新疆 烏魯木齊 830011)

消渴健脾膠囊是由葛根、白術、大黃、車前子、茯苓、蒼術、茵陳、梔子、丹參、土茯苓、萊菔子、厚樸、木瓜等十三味藥材組成的復方制劑，具有健脾燥濕、行氣和胃、祛濁化郁的功效。梔子具有利膽、鎮痛、降壓和抑菌抗炎的功效[1]，其主要成分有梔子苷、梔子苷酸、京尼平等[2]。研究表明，梔子苷具有抑菌[3]、利膽[4]、鎮痛[5]、保肝[6]、消炎[7]等作用。

消渴健脾膠囊中的蒼術、茵陳、梔子、丹參、土茯苓、萊菔子、厚樸、木瓜等八味藥材采用水提取，葛根、白術、大黃、車前子、茯苓等五味藥材粉碎。水提取的藥材中梔子苷等成分為水溶性，具有較強的生物活性，故以梔子苷含量為提取工藝的評價指標。

作者采用單因素實驗和正交實驗優化消渴健脾膠囊中梔子苷的提取工藝，以最大程度保留梔子苷成分，從而保證消渴健脾膠囊的藥效。

1 實驗

1.1 藥材、試劑與儀器

葛根、白術、大黃、車前子、茯苓、蒼術、茵陳、梔子、丹參、土茯苓、萊菔子、厚樸、木瓜，購自安徽亳州中藥材飲片有限公司，經新疆醫科大學姚藍副教授鑒定。

梔子苷標準品(批號：110749-200309)，中國藥品生物制品檢定所；乙腈，色譜純，Sigma公司;超純水。

Agilent 1200-DAD型高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；KQ-200KD型數控超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；AL204型電子分析天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；HH-S4型數顯恒溫水浴鍋，金壇醫療儀器廠；DL-1型電子萬用爐，北京永光明醫療儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 梔子苷標準溶液的制備

精密稱取梔子苷標準品0.62 mg，用甲醇定容于10 mL容量瓶中，得0.062 mg·mL-1梔子苷標準溶液。

1.2.2 梔子苷的提取

稱取蒼術23.0 g、茵陳23.0 g、梔子13.8 g、丹參23.0 g、土茯苓23.0 g、萊菔子34.5 g、厚樸13.8 g、木瓜34.5 g，加入一定量水浸泡30～60 min，煎煮2次，每次45 min，過濾，合并濾液，即得梔子苷提取液。

分別采用單因素實驗和正交實驗優化梔子苷提取工藝條件。

1.2.3 供試溶液的制備

將梔子苷提取液濃縮定容至200 mL容量瓶中。取1 mL濃縮液用超純水定容至10 mL容量瓶中，搖勻，經0.45 μm濾膜過濾后，取續濾液作為供試溶液。

1.2.4 色譜條件與梔子苷含量的測定

色譜柱為Column XB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈-水(15∶85，體積比，下同)，柱溫為30 ℃，流速為1.0 mL·min-1，檢測波長為238 nm，進樣量為10 μL。

分別精密吸取梔子苷標準溶液與供試溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀進行分析，測定梔子苷含量。消渴健脾膠囊按干燥品計算，梔子苷含量不得少于1.8%[8]。 梔子苷標準溶液和供試溶液的高效液相色譜圖見圖1。

圖1 梔子苷標準溶液(a)和供試溶液(b)的高效液相色譜圖

2 結果與討論

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 煎煮時間對梔子苷含量的影響

將藥材按加水量10倍加水浸泡30～60 min，分別煎煮30 min、45 min、60 min、90 min，煎煮2次，測定梔子苷含量，結果見圖2。

從圖2可以看出，煎煮45 min時，梔子苷含量最高。

2.1.2 加水量對梔子苷含量的影響

將藥材分別按加水量8倍、10倍、12倍、16倍加水浸泡30～60 min，煎煮2次，每次45 min，測定梔子苷含量，結果見圖3。

圖2 煎煮時間對梔子苷含量的影響

從圖3可以看出，加水量10倍時，梔子苷含量最高。

2.1.3 煎煮次數對梔子苷含量的影響

圖3 加水量對梔子苷含量的影響

將藥材按加水量10倍加水浸泡30～60 min，分別煎煮1次、2次、3次、4次，每次45 min，測定梔子苷含量，結果見圖4。

圖4 煎煮次數對梔子苷含量的影響

從圖4可以看出，煎煮2次，梔子苷含量最高。

2.2 正交實驗結果

以梔子苷含量為評價指標，以煎煮次數(A)、煎煮時間(B)和加水量(C)為考察因素，采取L9(34)正交實驗進行梔子苷提取實驗，因素與水平見表1，正交實驗的結果與分析見表2，方差分析見表3。

表1 正交實驗的因素與水平

從表2、3可以看出，以梔子苷含量為評價指標時，直觀分析結果顯示3個因素對提取工藝影響的順序為：煎煮次數>加水量>煎煮時間；方差分析顯示，煎煮次數對梔子苷含量有極顯著性影響，加水量對梔子苷含量有顯著性影響，煎煮時間對梔子苷含量無顯著性影響。因此，確定最佳提取工藝條件為A2B1C2，即加水量10倍、煎煮2次、每次30 min。

表2 正交實驗的結果與分析

表3 正交實驗的方差分析

2.3 驗證實驗

在最佳提取工藝條件下，平行煎煮藥材3份，測得梔子苷含量(mg·g-1)分別為0.279、0.286、0.281，平均值為0.282 mg·g-1，RSD值為1.28%。

經過驗證實驗，現提取工藝與原工藝(加水量10倍、煎煮2次、每次45 min)相比，提取的梔子苷含量相當，無顯著差異。現提取工藝煎煮時間短，減少了高溫對梔子苷的損耗。

2.4 討論

煎藥用水應選用潔凈澄清、無異味、雜質及礦物質含量少的水，一般生活飲用水即可。加水量應視藥材的質地、吸水量的多少、煎煮過程中的蒸發量及煎煮后所需的藥液量進行綜合考慮。加水量過少，藥材的有效成分不易煎出；加水量過多則煎煮時間勢必延長，使部分成分散失甚至破壞，正如《本草綱目》所云:“劑多水少，則藥味不出；劑少水多，又煎耗藥力”。實際應用時，一般加水量為將飲片適當加壓后，液面高出飲片約2 cm為宜。

中藥材大多是干燥品，有效成分多沉積于干涸、皺縮的藥材組織內，為了縮短煎煮時間，便于有效成分的煎出，通常煎煮前須加水浸泡30～60 min，煎煮過程中應根據藥材的質地和藥物的性質，控制火候及時間。一般煎藥宜先“武”后“文”，即用大火使藥液盡快沸騰， 然后改用小火保持微沸狀態30 min[9]。

本實驗選擇HPLC流動相時，首先采用了曲琰等[10]的條件，流動相為乙腈-水(13∶87)，流速1.0 mL·min-1，檢測波長238 nm。然后，采用了賀鵬等[11]的條件，流動相為乙腈-水(15∶85)，柱溫40 ℃，流速0.7 mL·min-1，進樣量5 μL；康艷萍等[12]的條件，流動相為甲醇-水(25∶75)，流速：泵A 0.25 mL·min-1、泵B 0.75 mL·min-1，檢測波長240 nm，進樣量20 μL；王謙等[13]的條件，流動相為乙腈-水(10∶90)，流速1.0 mL·min-1，柱溫25 ℃；朱慧慧等[14]的條件，流動相為甲醇-水(30∶70)，流速1.0 mL·min-1，柱溫25 ℃，檢測波長240 nm，進樣量10 μL。以上條件都存在不出峰、分離度不達標、色譜圖不達標等問題，不適于消渴健脾膠囊中梔子苷含量測定。

本實驗確定的色譜條件：色譜柱為Column XB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈-水(15∶85)，柱溫為30 ℃，流速為1.0 mL·min-1，檢測波長為238 nm，進樣量為10 μL。在此色譜條件下，色譜圖達標，分離度及理論塔板數良好。

3 結論

消渴健脾膠囊中的蒼術、茵陳、梔子、丹參、土茯苓、萊菔子、厚樸、木瓜等八味藥材采用水提取梔子苷。以梔子苷含量為評價指標，利用HPLC法測定梔子苷含量，采用單因素實驗和正交實驗優化梔子苷提取工藝條件。確定優化的提取工藝條件為：加水量10倍、煎煮2次、每次30 min，在此條件下，梔子苷含量為0.282 mg·g-1，正交實驗結果與驗證實驗結果一致。該提取工藝穩定、可靠、可行，可為消渴健脾膠囊中梔子苷含量測定和質量控制提供依據。