生熟大黃藥對對順鉑所致腎損傷小鼠的影響

琚皇進，楊 柱，唐東昕，羅 莉，龍奉璽，王鏡輝，郭 斌

(1.貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550025；2.貴州中醫藥大學 第一附屬醫院，貴州 貴陽 550002；3.德江縣民族中醫院，貴州 銅仁 565200)

順鉑(DDP)作為惡性腫瘤臨床常用的化療藥物，由于具有嚴重的腎毒性，使得臨床研究一度停滯。目前大多數腫瘤的治療首選藥物仍為順鉑，如膀胱癌、卵巢癌等[1]。我國由于順鉑導致的肝腎毒性、骨髓移植、神經毒性、胃腸道反應等，同樣困擾著廣大臨床醫生和患者。由于順鉑嚴重的腎毒性導致患者生活質量嚴重下降，迫使一些患者中斷化療而導致病情進一步惡化。順鉑在腎臟中的代謝特點具有高聚集性，故其劑量越高腎臟毒性越強，迫使臨床使用不得不嚴格控制劑量，但劑量的控制又使得療效得不到提高，嚴重影響臨床療效。

生熟大黃藥對為國醫大師劉尚義教授臨床針對腎損傷的常用藥對，在前期的臨床研究中發現生熟大黃對鉑類藥物所致腎損傷的病人具有一定的改善作用。因此本研究希望通過動物實驗證明生熟大黃具有改善順鉑所致腎損傷的作用，初步了解其作用機制，并為臨床運用提供證據。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

采用6～8周齡雄性清潔級BALB/c近交系小鼠40只，體質量(18±2)g，由長沙市天勤生物技術有限公司提供，許可證號：SCXK(湘)2018-014。適應性喂養1周，隨機分為生熟大黃高、中、低劑量組及模型對照組、空白對照組，每組8只。

1.2 實驗用藥

生熟大黃水煎液：由生大黃6 g、熟大黃6 g組成。由貴州中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科安全用藥規定(折合成小鼠劑量)熬制成60 mg生藥/mL、120 mg生藥/mL及240 mg生藥/mL 3種濃度的藥汁，100 mL真空包裝，4 ℃冰箱保存備用。順鉑由貴州中醫藥大學第一附屬醫院西藥房提供，規格為10 mg/瓶，齊魯制藥有限公司，國藥準字：H20073652，批號：AA1A8036A。

1.3 模型制備及給藥

分別給模型對照組，生熟大黃高、中、低劑量組，每組每只小鼠以順鉑4 mg/kg單次腹腔注射制作腎損傷模型[2]，空白對照組不予處理，給藥5天(前期實驗中發現順鉑給藥5天后小鼠出現尿素、肌酐及胱抑素C的升高，且腎小管多灶狀萎縮伴部分腎小管代償肥大，提示腎損傷模型造模成功)。生熟大黃高、中、低劑量組分別給予240 mg/mL、120 mg/mL及60 mg/mL濃度的生熟大黃水煎液灌胃，模型對照組給予0.13 mL/10 g/d蒸餾水灌胃；空白組不作任何處理；隔日稱體重1次，并根據體重變化調整灌胃劑量[2]。

1.4 觀察指標

1.4.1 小鼠血清BUN、SCR、胱抑素C的含量 生熟大黃水煎液灌胃2周后，禁食24 h后稱體重，摘眼球法取血[2]，用離心管迅速接血，常溫靜置1 h后，離心，ELISA檢測小鼠血清尿素氮、肌酐及胱抑素C的含量。

1.4.2 小鼠腎臟系數及腎臟病理切片 取出雙側腎臟稱重并計算腎臟系數；將其中一側腎固定于4%多聚甲醛中[2]，進行常規石蠟包埋、切片及HE染色，染色成功后于400倍光學顯微鏡下觀察腎小管上皮細胞、集合管上皮細胞及周圍炎性細胞浸潤情況和形態變化。

1.5 統計學方法

2.1 各組小鼠腎臟系數比較

模型對照組腎臟系數顯著上升，與空白對照組比較差異具有統計學意義(P<0.05)；生熟大黃各劑量組與模型對照組比較腎臟系數均降低，且差異具有統計學意義(P<0.05)；而各生熟大黃干預組之間比較，差異無統計學意義。

表1 各組小鼠腎臟系數比較

2.2 各組小鼠血清尿素氮、肌酐、血清胱抑素C含量變化

模型對照組與空白對照組比較，其BUN、SCR和胱抑素C均明顯升高，且差異具有統計學意義(P<0.05)；生熟大黃各劑量組與空白對照組比較，其BUN、SCR和胱抑素C均有不同程度升高，且差異具有統計學意義(P<0.05)，生熟大黃各劑量組與模型對照組比較，其BUN、SCR和胱抑素C均有不同程度下降，且差異具有統計學意義(P<0.05)。

表2 各組小鼠血清尿素氮、肌酐、血清胱抑素C比較

2.3 各組小鼠腎臟HE染色病理切片情況

空白組：腎組織結構正常，腎小管形態正常，且各結構間界限清晰。模型對照組：腎小管上皮細胞內出現大小不等的空泡伴上皮細胞脫落、壞死，基底膜不規則，見不均勻的皺縮及增厚現象，間質中有大量炎性細胞浸潤，小管內可見蛋白管型。3組生熟大黃治療組：腎小管上皮細胞空泡減少，基底膜增厚及皺縮情況得以改善，間質炎性細胞浸潤明顯減輕。見圖1。

圖1 腎組織病理特征(HE，×400)

3 討論

順鉑引起腎損傷，其主要表現為血中尿素氮、肌酐升高以及尿中出現透明管型等現象。順鉑所致腎損傷其作用靶位主要在腎小管，對近曲小管和集合小管的損傷尤為突出，其在病理表現為腎小管上皮細胞急性變性、壞死，間質水腫，小管擴張等。順鉑的腎損傷早期一般都是可逆的，但隨著藥物劑量的蓄積，亦可導致腎臟不可逆性損傷，嚴重時導致患者腎衰竭或者死亡。

隨著中醫藥的不斷發展，現代中醫學者對中藥干預順鉑所致腎損傷的研究方面取得重大進展，中醫藥在腫瘤患者化療中的增效減毒功效日益顯著。如有些中醫學者根據中醫理論：腎為先天之本，脾為后天之本，以“滲水利濕，溫陽化氣”為法則選用排毒利尿的五苓散治療順鉑所致的腎損傷取得了一定療效[3]。有學者以“清熱滋陰”為法，選用加味黃連阿膠湯干預順鉑所致的腎損傷，并通過動物實驗證實其療效[4]。另有學者采用益腎排毒之法進行干預，同時進行實驗證明其療效[5]。還有大量的中醫運用于此，諸如健脾養正消癥[6]、益腎養肝[7]、補腎滋陰[8]等，均取得很好的臨床療效。除復方研究外，現代中醫學者對單藥也做了諸多研究，如利用黃芪[9-13]的提取物進行了大量的體外實驗，證實了其療效。除黃芪以外，靈芝[14]、冬蟲夏草[15-16]等對順鉑所致腎損傷的保護作用也都得到證實。

現代中醫將“化療藥-順鉑”歸屬于“外邪”，外來之“藥毒”“邪毒”，雖治療惡性腫瘤，但加重了熱毒內蘊的癥狀，從而導致瘀毒互結。“清熱解毒化瘀”乃當務之急，選用生熟大黃水煎液清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀。且現代醫學研究發現生熟大黃水煎液有效成分的藥理作用研究主要集中在蒽醌類化合物，包括大黃酸、大黃素、大黃酚、蘆薈大黃素、大黃素甲醚等[17]，其對胃腸道、肝腎及心肌均具有保護作用，同時具有改善循環、抗腫瘤等作用。

本實驗發現，生熟大黃水煎液能降低小鼠腎臟系數及小鼠體內血尿素氮、血肌酐及胱抑素C的含量，同時改善小鼠腎小管損傷，提示生熟大黃水煎液對小鼠順鉑所致的腎損傷具有一定的改善作用，但其具體分子機制仍有待進一步深入研究。