小兒解表顆粒對發熱大鼠的解熱作用及機制研究

熊海均，甘青霞，彭誠藝，黃勤挽，王 瑾，湯婷婷，耿福能*

(1.成都中醫藥大學 藥學院，四川 成都 611137；2.好醫生藥業集團有限公司，四川 成都 610031)

小兒解表顆粒是治療小兒外感風熱所致感冒的常用中成藥[1]，收載于2010版、2015版《中國藥典》(一部)，由金銀花、連翹、炒牛蒡子、蒲公英、黃芩、防風、紫蘇葉、荊芥穗、葛根、人工牛黃 10味中藥組成[2]，其藥效較為溫和[3]，有助于改善患兒的臨床發熱癥狀，且不會增加不良反應，具有進一步應用和推廣的臨床價值[4]。本實驗通過利用大鼠復制LPS、2，4-二硝基酚和干酵母3種不同的發熱模型，明確小兒解表顆粒的解熱作用，并對2，4-二硝基酚發熱模型進行解熱機制研究，從而為進一步推廣小兒解表顆粒的臨床應用提供科學的實驗依據。

1 材料

1.1 藥物

小兒解表顆粒(國藥準字Z51021319，批號：180232，四川好醫生藥業集團有限公司)；柴黃顆粒(國藥準字Z19993380，批號：180402，四川百利天恒藥業股份有限公司)；小兒柴桂退熱顆粒(國藥準字Z20050716，批號：180339，葵花藥業集團襄陽隆中有限公司)。

1.2 試劑

2，4二硝基酚(批號：2015110101，成都市科龍化工試劑廠生產)；LPS(脂多糖)，來源于大腸桿菌O111：B4，貨號：L2630，Sigma公司；高活性干酵母粉，安琪酵母股份有限公司；大鼠NO ELISA試劑盒(96T)(批號：YCFTYZ7A44)，大鼠PGE2ELISA試劑盒(96T)(批號：6F3FY33UXJ)，大鼠GHRL ELISA試劑盒(96T)(批號：4V74BN51TP)，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；大鼠IL-1β ELISA試劑盒(96T)(批號：A301B80834)，大鼠IL-6ELISA試劑盒(96T)(批號：A30680851)，大鼠TNF-αELISA試劑盒(96T)(批號：A38280733)，大鼠IFN-γ ELISA試劑盒(96T)(批號：A38080214)，杭州聯科生物技術股份有限公司。

1.3 動物

SPF級SD大鼠，雄性，體重180～220 g，由成都達碩生物科技有限公司提供，動物合格證號：SCXK(川)2015-30。

1.4 儀器

YP30002型電子秤，感量：0.01 g，最大稱量：3 000 g(上海越平科學儀器有限公司)；醫用體溫計，型號：MMC-W201，測量范圍：32.0～42.0 ℃(北京小米科技有限責任公司)；UPH-Ⅰ-10T超純水器(成都超純科技有限公司)；AUW220D型十萬分之一電子天平(日本島津制作所)；L550型臺式低速離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)；SHHW21-600型三用電熱恒溫水箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；超低溫保存箱，型號：DW-86L338(J)，海爾集團；10～1 000 μL移液槍，熱電(中國)集團；XK96-3型微量振蕩器(江蘇新康醫療器械有限公司)；XW-80A型旋渦混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；Emax Plus酶標儀，Molecular Devices，LLC.；S10手持式高速勻漿機(寧波新藝超聲設備有限公司)。

2 方法

2.1 小兒解表顆粒對3種不同發熱模型的解熱作用

2.1.1 分組及給藥 取100只大鼠每天早晚各測量肛溫1次，連續3 d，篩選得到70只體溫恒定大鼠進入實驗。將合格大鼠分為7個組，每組動物10只，采用預防給藥方式，分別按照以下劑量分別灌胃給藥3 d。①空白對照組；②LPS模型對照組；③干酵母模型對照組；④2，4-二硝基酚模型對照組：給予5 mL/kg劑量的生理鹽水；⑤LPS模型+給藥組；⑥干酵母模型+給藥組；⑦2，4-二硝基酚模型+給藥組：5 mL/kg劑量的小兒解表顆粒藥液(0.5 g/mL)。

2.1.2 監測體溫變化 末次給藥1 h后進行造模，連續監測造模后幾小時的肛溫(因為3種致熱劑的發熱強度、持續發熱周期不同，所以檢測肛溫的時間間隔有所不同)。分別按照以下方式進行造模：2，4-二硝基酚組：在④和⑦組的各鼠背部按5 mL/kg的劑量皮下注射2，4-二硝基酚(30 mg/kg)，每隔20 min測量體溫，連續監測160 min；LPS組：在②和⑤組按5 mL/kg的劑量進行腹腔注射LPS(100 μg/kg)，剛開始每隔1 h測1次體溫，后面再隔0.5 h測1次體溫，連續監測7.5 h；干酵母組：在③和⑥組的各鼠背部按5 mL/kg的皮下注射干酵母混懸液(20%)，剛開始每隔1 h測1次體溫，后面再每隔0.5 h測體溫1次，連續監測7.5 h；空白對照組：在①組的各鼠背部按5 mL/kg的劑量皮下注射生理鹽水，其中，編號1～3的大鼠監測時間與2，4-二硝基酚組進行同步；編號4～7的大鼠監測時間與LPS(脂多糖)組同步；編號8～10的大鼠監測時間與干酵母組同步。

2.2 不同濃度的小兒解表顆粒對2，4-二硝基酚模型的解熱機制研究

2.2.1 分組及給藥 將體溫恒定的合格大鼠隨機分為7個組，每組10只，分別為：①空白對照；②2，4-二硝基酚模型對照組；③2，4-二硝基酚模型+小兒解表顆粒高劑量(0.5 g/mL)組；④2，4-二硝基酚模型+小兒解表顆粒中劑量(0.25 g/mL)組；⑤2，4-二硝基酚模型+小兒解表顆粒低劑量(0.125 g/mL)組；⑥2，4-二硝基酚模型+柴黃顆粒(0.25 g/mL)(陽性對照1組)；⑦2，4-二硝基酚模型+小兒柴桂退熱顆粒(0.75 g/mL)(陽性對照2組)。采用預防給藥方式，①～⑦組均連續灌胃給藥3 d(其中①～②組灌胃等體積純水，③～⑦組灌胃相應的藥液)。

2.2.2 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)技術檢測 末次給藥1 h后，②～⑦組進行發熱造模，各鼠背部按5 mL/kg的劑量皮下注射2，4-二硝基酚藥液(30 mg/kg)，在大鼠體溫達到最高點時，按1.5 mL/200 g體重腹腔注射20%烏拉坦溶液麻醉，腹主動脈采血，自然凝固2 h，將凝固的腹主動脈血，以3 500 r/min，離心5 min，取上清液得到血清，酶聯免疫吸附試驗(ELISA)技術檢測IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ、GHRL和β-EP。處死動物后，解剖取出下丘腦，用生理鹽水清洗，用濾紙吸干水分，稱重，再用10倍量的生理鹽水進行勻漿，得到勻漿液，以16 000 r/min，離心1 min，取上清液，采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)技術檢測cAMP、NO和PGE2。

2.3 統計學方法

數據運用SPSS 20.0統計軟件分析，計量資料以平均數±標準差表示，采用多組間單因素方差分析方法，P<0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 小兒解表顆粒對3種不同發熱模型的解熱作用

3.1.1 小兒解表顆粒對LPS模型的解熱作用 LPS組與空白對照組比較，從造模后2 h，溫度有一定的升高，但沒有統計學差異，持續到4 h，溫度又在降低；較大程度的溫度升高從5 h開始，一直持續到7 h，在5.5、6.0、6.5 h的時間點，均能顯著地升高大鼠體溫(肛溫)，P均<0.05，其中升溫的峰值在6.5 h，說明LPS發熱大鼠模型復制成功。

LPS+給藥組與LPS組比較，在發熱有顯著性增高的時間點上(5.5、6.0、6.5 h)，給藥組有降低大鼠體溫(肛溫)的作用，其中在升溫峰值的6.5 h時間點，能夠顯著性降低(P<0.05)。結果表明，小兒解表顆粒對LPS導致的發熱大鼠具有一定的解熱作用。但數據的整體波動較大(體現在標準差偏大)，詳見表1。

表1 對LPS發熱大鼠的體溫(肛溫)影響

3.1.2 小兒解表顆粒對2，4-二硝基酚模型的解熱作用 2，4-二硝基酚組與空白對照組比較，從造模后20 min，一直到140 min，均能顯著地升高大鼠體溫(肛溫)(P<0.05)，其中升溫的峰值在80～100 min，說明2，4-二硝基酚發熱大鼠模型復制成功。2，4-二硝基酚+給藥組與2，4-二硝基酚組比較，在造模后20 min，給藥組能顯著地降低大鼠體溫(肛溫)(P<0.01)；而在后續的時間點中，同樣有一定程度的降低大鼠體溫(肛溫)(P>0.05)，差異無統計學意義。結果表明，小兒解表顆粒對2，4-二硝基酚導致的發熱大鼠具有一定的解熱作用，主要體現在模型復制后的20 min，詳見表2。

表2 對2，4-二硝基酚發熱大鼠的體溫(肛溫)影響

3.1.3 小兒解表顆粒對干酵母模型的解熱作用 干酵母組與空白對照組比較，從造模后4 h開始，一直持續到本次實驗觀察的7.5 h，均能顯著地升高大鼠體溫(肛溫)(P<0.05)，其中升溫的峰值有“雙峰”現象，分別在5.5 h和7.0 h，說明干酵母發熱大鼠模型復制成功。干酵母+給藥組與干酵母組比較，在發熱升溫最高的“雙峰”兩個時間點上(5.5、7.0 h)，給藥組均有一定降低大鼠體溫(肛溫)的作用(P>0.05)，差異無統計學意義。結果表明，小兒解表顆粒對干酵母導致的發熱大鼠具有一定的解熱作用，但作用不顯著，見表3。

表3 對干酵母發熱大鼠的體溫(肛溫)影響

3.2 不同濃度小兒解表顆粒對2，4-二硝基酚模型的解熱機制

3.2.1 對下丘腦中cAMP、NO、PGE2的影響 與空白組大鼠比較，模型組大鼠下丘腦中cAMP、NO、PGE2均高于空白組(P<0.01)，差異有統計學意義，說明造模成功。與模型組比較，兩個陽性組中，柴桂組對NO的降低不明顯(P>0.05)，差異無統計學意義；不同濃度的小兒解表顆粒均能一定程度降低下丘腦中cAMP、NO、PGE2的含量，但解表中組對cAMP和解表低組對cAMP、NO的降低不明顯(P>0.05)，差異無統計學意義，cAMP、NO、PGE2解表高組顯著降低(P<0.05)，差異有統計學意義。說明高劑量的小兒解表顆粒能有效抑制2，4-二硝基酚致大鼠發熱引起下丘腦中的cAMP、NO和PGE2值升高，見表4。

表4 各組大鼠下丘腦cAMP、NO、PGE2含量比較

3.2.2 對血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ、GHRL、β-EP的影響 與空白組大鼠比較，模型組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ、GHRL和β-EP含量均顯著高于空白組(P<0.01)，差異有統計學意義，說明造模成功。與模型組比較，兩個陽性對照組中，柴黃組對TNF-α的降低不明顯(P>0.05)，差異無統計學意義，柴桂組對IL-6的降低不明顯(P>0.05)，差異無統計學意義；不同濃度的小兒解表顆粒均不同程度地降低大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ、GHRL和β-EP含量(P<0.05)，差異有統計學意義。說明不同濃度的小兒解表顆粒均能有效抑制2，4-二硝基酚致大鼠發熱引起血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ、GHRL和β-EP值的升高，且較兩個陽性藥效果更好，見表5。

表5 各組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ、GHRL、β-EP含量比較

4 討論

發熱是機體抵抗入侵病原體的非特異性系統反應。脂多糖(LPS)作用于機體免疫細胞釋放致熱型細胞因子，其通過體溫調節中樞，打破機體的產熱和散熱平衡而發熱[5]；2，4-二硝基酚為化學性質熱源，其致熱機制為通過刺激細胞氧化過程，發熱為機體的一種保護機制，在發熱情況下能做出有益的反應，機體的免疫功能產生變化[6]，其升溫后持續時間較短[7]；干酵母所致的發熱是由于注射部位的局部潰爛引發的劇烈炎癥反應[8]。實驗結果表明，小兒解表顆粒對3種發熱模型均能發揮一定程度的解熱效果，與其發熱機制密切相關。而對2，4-二硝基酚熱源的解熱效果最佳，說明小兒解表顆粒具有發揮解熱作用迅速的特點。

發熱是由發熱激活物刺激機體的產內生致熱源細胞釋放內生致熱原(EP)，TNF-α是重要的EP之一[9]，IL-1β、IL-6也是常見的內源性熱原細胞因子，可以直接或間接作用于體溫調節中樞的神經細胞，引起體溫變化[10-12]。目前比較公認的體溫調節中樞介質有PGE2和cAMP[13]。實驗結果表明，小兒解表顆粒能有效降低大鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-6及下丘腦cAMP、PGE2。IL-1β、TNF-α、IL-6是最常見的致熱炎性因子[14-15]，由于IL-6為最終的內生致熱原[16]，因此TNF-α的產生或釋放，繼而引起了IL-6的改變，使PGE2和cAMP合成減少，從而發揮解熱作用。

NO參與機體免疫防御、細菌殺傷、吸收等功能的調節，機體發熱時，與體內自由基代謝紊亂有關。因此，當有內外源性損害時機體就會產生發熱，機體內NO的含量明顯增加[17]。IFN是動物細胞在受到誘生刺激后產生的一組具有抗病毒、參與免疫調節等多種生物活性的細胞因子[18]，IFN-γ是一種免疫調節的多效性因子[19]。GHRL具有抑制炎癥反應發生、參與神經調節的作用[20]。β-EP是一種具有免疫性作用的內源性阿片肽，當機體內外環境發生巨大改變時，可參與機體各系統功能的調節過程[21]。大鼠在受到2，4-二硝基酚的刺激后，下丘腦中NO和血清中IFN-γ、GHRL、β-EP含量均顯著升高，參與機體免疫調節，給藥后均有效降低其含量，表明小兒解表顆粒能有效降低大鼠受到的刺激，發揮解熱作用。

小兒解表顆粒具有宣肺解表、清熱解毒的功效，臨床上主要用于小兒外感風熱所致的感冒，對不同發熱模型均有一定程度的解熱作用。各濃度小兒解表顆粒參與免疫調節，抑制2，4-二硝基酚誘導大鼠發熱外周細胞因子的釋放和中樞升溫介質的釋放及相關炎癥因子含量的升高而發揮解熱作用，且通過機制研究發現，小兒解表顆粒解熱效果的優勢明顯。小兒解表顆粒主治發熱惡風、頭痛咳嗽、鼻塞流涕、咽喉痛癢，解熱機制的研究只是其中一部分，為了更好推廣小兒解表顆粒的臨床應用，還需要更多更進一步的研究。