壯醫桉楝雙蓮方治療小鼠ACD慢性瘙癢的止癢作用研究

莫嵩杰，謝祥官，黃振飛，韋麗珍，覃水云，黃海月，伍冠一，張 煜，溫海成

(廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530001)

瘙癢是一種令人不愉快、引起強烈搔抓欲望的皮膚感覺，是皮膚病最常見的癥狀之一，有超過1/3的就診者會發生這種癥狀，其中大部分屬于慢性[1-2]。瘙癢不僅可加重炎癥，而且還會導致睡眠嚴重缺失，嚴重影響患者及其家庭的生活質量[3]。壯族地區常年氣候潮濕，常見痧、瘴、蠱毒引起的疾病。該地皮膚病大多夾濕，在長期與疾病作斗爭的過程中，壯族先民積累了許多治療皮膚瘙癢癥的經驗[4]。

按照壯醫理論，瘙癢病常因毒邪入侵人體三道兩路(水道、氣道、谷道、龍路、火路)和皮膚，導致三道兩路功能失常而致病。在壯族民間常用壯醫桉楝雙蓮方治療日常生活中的各類皮膚瘙癢病，通過藥浴的方式，以達到改善或治愈皮膚瘙癢病的目的。壯醫桉楝雙蓮方治療瘙癢病以解毒、暢通龍路火路與疏通氣道水道為主，大葉桉、七葉蓮都有疏通氣道、祛風邪的作用，大葉桉具有消熱解毒、收斂生肌、祛風止癢之功效；七葉蓮具有除濕毒、活血行氣止痛之功效；苦楝皮具有強烈的殺蟲療癬的功效，可治療由皮膚受蟲毒而導致的瘙癢；兩面針，壯名又叫入地金牛，有疏通龍路火路的作用，可治療因邪郁閉于龍路火路，兩路受阻而導致皮膚瘙癢的病證；穿心蓮，可疏通水道，使導致皮膚瘙癢的毒邪從水道中排出，從而起到治療皮膚瘙癢的作用[5]。壯醫桉楝雙蓮方通過疏通龍路火路、暢通氣道水道，使人體之毒邪祛除于體外，從而發揮治療疾病的效果。雖然壯醫桉楝雙蓮方在民間使用范圍較廣，但是其對慢性瘙癢的治療機理和療效并不明晰。因此，本研究在壯醫基礎理論指導下，通過建立變態接觸性皮炎(Allergic contact dermatitis，ACD)模型，采用血液檢測技術來檢測桉楝雙蓮方干預前后小鼠血液(抗癢物質)成分表達水平變化及瘙癢導致的潰爛皮膚的愈合情況，研究不同劑量的壯醫桉楝雙蓮方對治療ACD模型小鼠慢性瘙癢的作用，探討其治療皮膚瘙癢病的療效，為桉楝雙蓮方進一步開發和利用，提供前期研究基礎，為今后其在臨床上治療皮膚瘙癢病提供重要的實驗依據和參考。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗動物

雄性ICR小白鼠45只，5～7周齡，體重為(29±4)g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，合格證號：SCXK(湘) 2016-0002。飼養環境：溫度(24±2) ℃，相對濕度50%～70%(RH)，晝夜間歇光照，給予SPF級飼料和純凈水。

1.2 藥品與試劑

大葉桉200 g、七葉蓮200 g、兩面針200 g、穿心蓮200 g、苦丁茶200 g、金銀花藤200 g、龍膽木200 g、苦楝皮200 g(購置于普通藥材鋪)；醋酸地塞米松片(浙江仙琚制藥股份有限公司，生產批號：160444)；丙酮、歐麗薇蘭特級初榨橄欖油(生產批號：F20170609)；氯化鈉溶液(石家莊四藥有限公司，生產批號：1611221902)；2，4-二硝基氟苯(SIGMA-ALDRICH，生產批號：BCBR8143V)；小鼠免疫球蛋白E(IgE)酶聯免疫吸附測定試劑盒(伊萊瑞特，生產批號：E-EL-M0691c)；小鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯免疫吸附測定試劑盒(伊萊瑞特，生產批號：E-EL-M0049c)；小鼠白介素6(IL-6)酶聯免疫吸附測定試劑盒(伊萊瑞特，生產批號：E-EL-M0044c)；小鼠白介素1β(IL-1β)酶聯免疫吸附測定試劑盒(伊萊瑞特，生產批號：E-EL-M0037c)；小鼠白介素4(IL-4)酶聯免疫吸附測定試劑盒(伊萊瑞特，生產批號：E-EL-M0043c)；小鼠白介素13(IL-13)酶聯免疫吸附測定試劑盒(伊萊瑞特，生產批號：E-EL-M0727c)組胺(HIS)酶聯免疫吸附測定試劑盒(伊萊瑞特，生產批號：E-EL-0032c)；小鼠白介素31(IL-31)酶聯免疫吸附測定試劑盒(優爾生，生產批號：SEB179Mu)。

1.3 實驗儀器與設備

HDR-CX405型數碼HD攝錄一體機(上海索尼電子有限公司)；SQP型電子天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)；YE3B16062移液槍(1 000～5 000 μL )、YE3K149048移液槍(100～1 000 μL)、YE3K145273移液槍(5～50 μL)(大龍興創儀器(北京)有限公司)；BCD-290W型冰箱(青島海爾股份有限公司)；C2500-R-230V型微型高速離心機(美國Labnet)；ICV-450型電熱恒溫培養箱(日本ASONE)；MuLtiskan MK3型全自動酶標儀(Thermo scientific)。

1.4 小鼠ACD模型建立

參照文獻[6]的方法建立小鼠ACD模型。48只ICR小鼠適應性飼養1周后，隨機分為6組，分別為空白對照組、造模組(0.2% DNFB)、壯醫桉楝雙蓮方低劑量組、壯醫桉楝雙蓮方中劑量組(20 mg/kg)、壯醫桉楝雙蓮方高劑量組(50 mg/kg)、陽性對照組(地塞米松，5 mg/mL)，每組各8只。除空白對照組外，其他組實驗前5天剃除頸背部毛發(面積約為3 cm×3 cm)，剃除小鼠腹部毛發(面積約為4 cm×4 cm)，使皮膚完全暴露出來。提前3天對小鼠腹部皮膚給予0.5%DNFB(丙酮∶橄欖油4∶1稀釋)，給藥量為100 μL/只。第0天對小鼠頸部剃毛部位給予0.2%DNFB(丙酮∶橄欖油按4∶1稀釋)，給藥量為100 μL/只，之后每周用0.2%DNFB進行3次頸部皮膚的敏化(具體敏化時間見圖1)給藥量為100 μL/只。空白組不予用藥，造模組僅致敏給藥，給藥量為100 μL/只，每周3次進行皮膚敏化；其余4組在需要進行敏化的當天，上午7點進行相應的藥物治療，下午5點進行0.2% DNFB皮膚敏化，除開致敏的天數，其余每天均按時進行相應的藥物治療給藥，直至實驗結束，實驗共進行25天。

1.5 檢測指標和方法

1.5.1 小鼠瘙癢行為學觀察 通過小鼠的搔抓行為對比來評價瘙癢的嚴重程度。小鼠瘙癢行為學錄制在給予小鼠腹部0.5%DNFB敏化后1天開始進行(即實驗的第1、4、11、19、24天)(實驗進程見圖1)提前5 min將小鼠放進亞克力板方形的透明盒子里適應環境，15 min后在安靜、無干擾的環境中持續拍攝小鼠1 h，由不知情人員對回放錄像中每只小鼠的搔抓次數進行統計。一次搔抓是指小鼠的后爪抓撓頸部藥物的部位的一次或多次動作，當后爪落在地上或被舔和咬，就代表一次搔抓的結束。小鼠前肢運動和前爪、耳、腹劃傷均無統計學差異。

圖1 實驗進程

1.5.2 瘙癢相關細胞因子檢測 通過眼球提取獲得小鼠全血，離心保存，按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測小鼠血清中IgE、TFNα、IL13、IL31濃度水平的變化。

1.5.3 統計學方法 所有實驗數據均采用柱狀圖和折線圖的形式，以(mean±SEM，N=x)表示，采用GraphPad Prism軟件進行相關數據分析，根據數據類型分別采用單因素方差分析，組間比較行t檢驗。

2 實驗結果

2.1 ACD模型小鼠的皮膚觀察

在每次給予小鼠DNFB刺激前，按照評分標準(評分標準見表 1)，對小鼠的皮膚情況一一進行評分。實驗第14天進行皮膚評分(評分標準見圖2)，結果顯示：不同劑量的壯醫桉楝雙蓮方對ACD模型小鼠皮膚的影響程度不同。空白組小鼠皮膚光滑平整毛順，造模組小鼠皮膚潰爛明顯(圖4.B/圖3.B)，高劑量壯醫桉楝雙蓮方組小鼠皮膚基本無損傷(圖4.F/圖3.F)，高劑量壯醫桉楝雙蓮方減輕皮膚潰爛效果相對較好；而低(圖4.D/圖3.D )、中(圖4.E/圖3.E)劑量組和陽性對照組小鼠(圖4.C/圖3.C)基本已經有了結痂，但小鼠皮膚受損及潰爛程度相對造模組小鼠來說較輕；壯醫桉楝雙蓮方高劑量組小鼠皮膚受損及潰爛程度與陽性對照組相比較(參考圖3/圖4，圖4為圖3完整圖)，皮膚受損情況無明顯差異。造模組(0.000±0.000，N=7)，壯醫桉楝雙蓮方低劑量組(1.125±0.109，N=8)，壯醫桉楝雙蓮中劑量組(1.857±0.484，N=7)，壯醫桉楝雙蓮方高劑量組(1.500±0.490，N=6)，及陽性對照組(0.188±0.333，N=6)，造模組與壯醫桉楝雙蓮方中、高劑量組，有顯著差異(P<0.01)；造模組與陽性對照組比較，無統計學差異(P>0.05)；壯醫桉楝雙蓮方低、中、高劑量組與陽性對照組比較，均無統計學差異(P>0.05)(見圖5、圖6)。

表1 評分標準

圖2 評分標準

圖3 不同組別小鼠皮膚損傷情況

圖4 不同組別小鼠皮膚損傷情況(為圖3完整圖)

圖5 不同小組小鼠皮膚潰爛程度評分

圖6 實驗室第14天各組小鼠皮膚評分

2.2 ACD模型小鼠的行為學觀察

接觸性皮炎的一個重要臨床癥狀是自發慢性瘙癢，為了對皮膚的瘙癢程度進行量化，我們使用小鼠的后爪刮擦剃毛部位的次數作為判斷瘙癢程度的指標。觀察ACD模型小鼠慢性瘙癢行為，我們發現與空白對照組相比，造模組小鼠瘙癢行為的數量顯著增加(P<0.01)。壯醫桉楝雙蓮方中、高劑量組分別與造模組比較，有顯著性差異(P<0.05)；壯醫桉楝雙蓮方低劑量組與造模組相比較，結果無統計學差異(P>0.05)。實驗結果表明：壯醫桉楝雙蓮方可以減輕受到藥物刺激的小鼠的慢性瘙癢行為，但是不明顯，僅有壯醫桉楝雙蓮方低劑量組的效果較為明顯，而壯醫桉楝雙蓮方中、高劑量組無明顯效果，壯醫桉楝雙蓮方組與陽性對照組相比較，低劑量組抑制瘙癢的效果比地塞米松作用強。見表2。

表2 不同劑量壯醫桉楝雙蓮方對ACD模型小鼠慢性瘙癢的影響

2.3 小鼠血清瘙癢相關因子濃度水平變化

本研究將壯醫桉楝雙蓮方低、中、高劑量組與造模組進行比較，結果發現，小鼠血清中抗炎癥因子IgE、TFN-α、IL-13、IL-31表達量無明顯降低(P>0.05)，陽性對照組與壯醫桉楝雙蓮方低劑量組比較，表達量無統計學差異(P>0.05)，陽性對照組與壯醫桉楝雙蓮方中、高劑量組比較，表達量無統計學差異(P<0.05)。表明壯醫桉楝雙蓮方不能明顯降低ACD模型小鼠血清中IgE、TFN-α、IL-13、IL-31濃度。見圖7-圖10。

圖7 壯醫桉楝雙蓮方對ACD模型小鼠IgE濃 度水平變化的影響

圖8 壯醫桉楝雙蓮方對ACD模型小鼠TNF-α濃 度水平變化的影響

圖9 壯醫桉楝雙蓮方對ACD模型小鼠 IL-13濃 度水平變化的影響

圖10 壯醫桉楝雙蓮方對ACD模型小鼠 IL-31濃 度水平變化的影響

3 討論

慢性瘙癢是常見的皮膚病，影響著人們的工作和生活，壯醫桉楝雙蓮方在民間的臨床使用范圍較廣，但是其對慢性瘙癢的治療機理和療效并不明晰。本實驗對經DNFB敏化以及藥物治療的ACD模型小鼠進行了行為學觀察，通過對行為學數據、實驗小鼠血清檢測數據、小鼠皮損評分數據以及小鼠體重變化等數據的分析，探討壯醫桉楝雙蓮方治療小鼠ACD慢性瘙癢的治療機理和療效研究。

通過對血液中各種炎性細胞因子檢測結果的統計學分析﹙兩組間t檢驗﹚，結果發現：本實驗中壯醫桉楝雙蓮方對ACD模型小鼠的慢性瘙癢無明顯抑制作用。實驗結果誤差分析表明：①在實驗初期，因對實驗流程與具體用藥不夠熟悉，導致空白對照組多只小鼠因實驗操作失誤而被處死，使空白組小鼠的實驗數據缺失，最終實驗缺少了標準對照數據的分析；②治療藥物的提取，采用傳統的水煎濃縮法提取實驗藥物，提取到的藥液含雜質較多，藥液純度低。當藥物用于實驗小鼠局部皮膚時，藥物就會附著在小鼠局部皮膚，這就變成了一種促進局部炎癥發生的因素，且藥物的附著也會使小鼠局部皮膚不能保持干燥，從而影響小鼠炎癥的愈合，再者附著的藥物影響了后續小鼠的給藥治療和局部藥物的吸收，進一步影響了壯醫桉楝雙蓮方對ACD模型小鼠慢性瘙癢的治療；③在后續對小鼠給藥治療時，由于濃縮藥物黏度過大，有部分藥物不可避免地黏附在儀器槍上，導致給藥量偏低，從而影響壯醫桉楝雙蓮方的治療效果；④在實驗后期，對小鼠眼部取血樣時，由于操作不當和部分小鼠體重過低、所采集的血液太少，達不到血清檢測的最低標準，減少了實驗部分血清檢測數據，導致組與組之間組數差別過大，對后面實驗數據的分析產生了較大影響。

雖然實驗結果表明壯醫桉楝雙蓮方對ACD模型小鼠瘙癢無明顯抑制作用，但通過改變壯醫桉楝雙蓮方藥液的提取方式，提高提取純度，減少人為因素的影響，可以進一步驗證壯醫桉楝雙蓮方對ACD模型小鼠慢性瘙癢的抑制作用。本研究在一定程度上可對將來深入開展壯醫桉楝雙蓮方抗慢性瘙癢的相關研究提供參考。