醬鹵肉制品中雜環胺的生成及分離檢測技術研究進展

孟圓 孟醒 夏秀芳

摘 要：醬鹵肉制品是我國典型的傳統肉制品，在生產加工過程中會產生一類致癌致突變的芳香烴類化合物雜環胺。雖然醬鹵肉制品的加工溫度較溫和，但由于其加工方式的特殊性，也導致了大量雜環胺的產生。本文針對醬鹵肉制品加工過程中雜環胺的形成機理、影響因素進行綜述，以期為今后醬鹵肉制品中雜環胺的研究及相應抑制措施提供進一步的科學依據。同時總結現階段肉制品中雜環胺的分離檢測技術，對現存檢測技術的優點及局限性進行分析及評估，為今后雜環胺的分析處理技術提供科學參考和指導方向。

關鍵詞：雜環胺;醬鹵肉制品;形成機理;影響因素;分離檢測技術

Abstract： Soy sauce and pot-roast meat products are typical traditional Chinese meat products. Despite the mild temperature during their production and processing， a large number of heterocyclic amines， a class of carcinogenic and mutagenic aromatic hydrocarbon compounds， can be generated due to the use of the special processing methods. This paper reviews the mechanism of the formation of heterocyclic amines in soy sauce and pot-roast meat products and the factors influencing it during processing in order to provide a scientific basis for future research on heterocyclic amines and developing countermeasures to inhibit their formation. Simultaneously， the currently available methods for the separation and detection of heterocyclic amines from the meat products are summarized， and their advantages and limitations are analyzed， which will provide scientific reference and directions for the analysis and processing of heterocyclic amines in the future.

Keywords： heterocyclic amines; soy sauce and pot-roast meat products; formation mechanism; factors; separation and detection technologies

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200422-099

中圖分類號：TS251.5 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2020）08-0091-11

引文格式：

孟圓， 孟醒， 夏秀芳. 醬鹵肉制品中雜環胺的生成及分離檢測技術研究進展[J]. 肉類研究， 2020， 34（8）： 91-101. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200422-099. ? ?http：//www.rlyj.net.cn

MENG Yuan， MENG Xing， XIA Xiufang. Progress in understanding the formation of heterocyclic amines in soy sauce and pot-roast meat products and a review of separation and detection technologies[J]. Meat Research， 2020， 34（8）： 91-101. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200422-099. ? ?http：//www.rlyj.net.cn

醬鹵肉制品是一類以畜禽肉及其副產品為原料，經煮制調味等工藝加工而成的中式傳統肉制品[1]，其加工的關鍵在于鹵煮和調味。醬鹵肉制品在加工過程中常產生一類致癌、致突變性的多環芳香族化合物——雜環胺（heterocyclic aromatic amines，HAAs），HAAs普遍產生于蛋白質含量豐富的食品經高溫油炸、煎烤或長時間烹調等加工過程[2]。醬鹵肉制品是在溫度相對較低（<100 ℃）的條件下進行加工，鹵煮雖是較溫和的加熱過程，但研究發現醬鹵肉制品在經過反復長時間的鹵煮后，其總HAAs含量會提高1～3 個數量級[3]，且形成的HAAs種類及數量區別于煎炸、烘烤等高溫處理肉制品。

20世紀70年代末，人們在烤魚和烤牛肉炭化表層中發現了HAAs。至今在各類烹調食品中發現并分離鑒定出的HAAs己超過30 種[4]。國際癌癥研究機構基于長期的動物實驗分析將HAAs分為人類可能致癌物（2A級）及人類潛在致癌物（2B級）兩大類。流行病學研究發現，長期攝入HAAs會造成人體多種組織和器官的損壞，甚至誘發結腸[5]、胰腺[6]、前列腺[7]、乳腺[8]、輸尿管[9]等靶器官的癌變，增加阿爾茲海默癥[10]的患病風險。同時研究發現，HAAs的致突變能力極強，是亞硝酸鹽、黃曲霉毒素B1和苯并芘的數十倍甚至數百倍以上[7]。但烹調肉制品中HAAs結構復雜，且僅以痕量水平存在，因此高效、準確地分離、檢測HAAs，對HAAs的研究分析至關重要。

本文系統綜述醬鹵肉制品中HAAs的形成機理、影響因素及分離檢測肉制品中HAAs的技術手段，為抑制醬鹵肉制品實際生產加工中HAAs的形成以及快速、準確檢測HAAs提供一定的參考。

1 醬鹵肉制品中HAAs的形成機理

HAAs可分為熱反應型HAAs（氨基咪唑氮雜芳烴類）和熱解型HAAs（氨基咔啉類）2 種，熱反應型HAAs通常形成于典型烹飪/油炸溫度下（200 ℃），而熱解型HAAs通常在高于250 ℃的溫度下通過分解氨基酸和蛋白質形成[11-12]。

1.1 氨基咪唑氮雜芳烴類HAAs形成機理

不同的氨基咪唑氮雜芳烴化學結構相似，都存在咪唑環、吡啶或吡嗪環。氨基咪唑氮雜芳烴類HAAs包括咪唑喹啉類、咪唑喹喔類及咪唑吡啶類化合物。咪唑吡啶類化合物中的2-氨基-1-甲基-6-苯基-咪唑并[4，5-b]吡啶（2-amino-1-methyl-6-phenyl-imidazo[4，5-b]pyridine，PhIP）的形成途徑早已明確（圖1），而喹啉和喹喔啉類HAAs形成機制尚未完全明確，可能存在2 種途徑：一種是羰基途徑[13]（圖2），食品中含有的碳水化合物、脂質、氨基酸等可作為反應型羰基的主要來源，反應型羰基化合物趨向于進行環化和低聚，從而產生HAAs。反應型羰基的形成也有利于其他羰基的生成，為形成香味前體物質提供物質基礎[14]。同時適當醛在含氨以及產生氨的化合物中會產生大量的吡啶、吡嗪類物質，肌酸酐的存在一定程度上能夠提供生成吡啶、吡嗪類物質所需的氨[15]。吡啶環、吡嗪環的形成是咪唑喹啉類（imidazoquinoline，IQ）和咪唑喹喔啉類（imidazoquinoxaline，IQx）HAAs的重要區別，美拉德反應過程中α-二羰基化合物經Strecker降解產生吡嗪環[16]，吡啶除在美拉德反應中被檢測產生之外，脂質衍生的羰基胺反應中存在大量的活性羰基，此途徑也能夠形成吡啶，從而通過脂質的環化和低聚產生HAAs[17]。目前，具體的羰基種類對應形成的HAAs種類仍有待確定，但是充分了解食品中羰基的變化途徑也將為進一步認識及抑制HAAs形成提供參考。喹啉和喹喔啉類HAAs形成的另一途徑是自由基途徑，因其完整的形成過程缺少步驟而存在一定的爭議性，尚未得到證實，大致形成途徑為美拉德反應生成吡啶和吡嗪自由基，它們與肌酐、相應醛可形成具有喹啉（IQ衍生物）或喹喔啉（IQx衍生物）結構的HAAs[18]。

1.2 氨基咔啉類HAAs形成機理

肉制品中的熱解型HAAs可由游離氨基酸、蛋白質等發生熱解作用形成。大部分的熱解型HAAs在溫度高于250 ℃條件下產生，β-咔啉類HAAs產生條件對于溫度的要求低于其他咔啉類HAAs（熱降解HAAs），常出現在溫度相對較低的肉類或肉制品加工過程中[7]，可以通過低溫長時間加工而大量產生。研究表明，醬鹵肉制品中含量最多的HAAs為β-咔啉類HAAs，高出其余HAAs數倍到數十倍，由于β-咔啉類HAAs在Ames實驗中沒有表現出突出的致變性，雖然目前在食品行業未得到重視，但是仍具有間接致癌性[3]，被世界衛生組織國際癌癥研究機構列入2B類致癌物，β-咔啉類HAAs自身毒性不強，但是會作為輔助致突物，誘變增強其他有害物質的毒性，還會對神經組織造成一定毒性。

β-咔啉類HAAs包括9H-吡啶并[2，3-b]吲哚（9H-pyrido[4，3-b]indole，Norharman）、1-甲基-9H-吡啶并[2，3-b]吲哚（1-methyl-9H-pyrido[4，3-b]indole，Harman）2 種，其形成機制類似，目前Norharman的形成途徑較為明確（圖3），存在2 個主要形成途徑：1）色氨酸先經過Amadori重排后脫水，其產物在環氧孤對電子存在的條件下發生β-消去反應，進而形成共軛的氧鎓離子，此反應中間體可通過進一步脫水和形成拓展的共軛體系穩定自身或C-C鍵斷開后進行分子取代反應，最終形成β-咔啉類HAAs[6];2）β-咔啉可由色氨酸與乙醛或α-酮酸通過Pictet-Spengler反應形成四氫化-β-咔啉（tetrahydro-β-carbolines，THβC），再經進一步的氧化/脫羧或其他加工過程形成[3]。

2 醬鹵肉制品中HAAs形成的影響因素

2.1 原料肉的脂肪與水分含量

目前研究發現，脂肪含量對HAAs的作用機制存在以下3 種觀點：一是化學作用，脂肪氧化產生自由基參與美拉德反應，產生吡嗪、吡啶類物質，促進極性HAAs的形成[19];二是用物理因素來解釋，脂肪為熱傳遞介質，會影響傳熱效率，從而導致HAAs的含量變化[20];三是脂肪可以稀釋前體物質，減少其互相接觸的機會及面積，也可以影響HAAs的形成[21]。而水分的存在也能夠一定程度上稀釋前體物質，減少其相互接觸機會，從而抑制HAAs形成[22]。

不同原料肉品種或同一原料肉品種不同部位的脂肪含量有所差別，郭海濤[19]通過對9 種HAAs含量進行檢測得出結論：隨著脂肪含量在較小幅度內增加（0%～15%），極性HAAs含量顯著提高，但當脂肪含量增加到20%，除了PhIP外，其余極性HAAs含量的增加趨勢不顯著，但仍呈現增長趨勢，而非極性HAAs主要來自于氨基酸的熱降解作用，與脂肪含量不存在顯著相關性。原料肉的不同品種[23]、部位[24]、表面積和形狀[19]也對HAAs的產生有顯著影響。研究人員發現，對于不同烹飪加工手段制得的肉制品，水分含量越多，HAAs形成種類及含量越少，經鹵汁熬制的醬鹵肉制品中存在的部分HAAs含量相比于直接暴露在高溫油炸條件下的肉制品有所減少[22]。

2.2 鹵煮時間及次數

鹵水煮制是加工醬鹵肉制品的關鍵步驟之一，是滋味來源的主要途徑，傳統的醬鹵肉制品要在鹵水中經過長時間的煮制加工。鹵水又有新鹵、老鹵之分，新鹵經過反復鹵煮就會變成老鹵，鹵水經過反復的煮制加工會出現更多的滋味物質，使得醬鹵肉制品味道更佳，但同時也導致有害致癌物質的不斷產生和積累。鹵水的反復加工對肉品色澤、pH值、灰分、風味物質、游離氨基酸及核苷酸含量等均產生不同程度的影響，同時也對亞硝酸鹽蓄積及致癌致突變物質產生具有一定促進作用[25]。邵斌[26]發現，隨著鹵煮時間的延長，鹵煮燒雞的雞肉及雞皮中Horman、Norharman、3-氨基-1，4-二甲基-5H-吡啶并[4，3-b]吲哚（3-amino-1，4-dimethyl-5H-pyrido[4，3-b]indole，Trp-P-1）、3-氨基-1-甲基-5H-吡啶并[4，3-b]吲哚（3-amino-1-methyl-5H-pyrido[4，3-b]indole，Trp-P-2）4 種HAAs含量均呈明顯的上升趨勢，且當鹵煮次數達到20 次以上時，IQ和2-胺基-3，4，8-三甲基-3H-咪唑并[4，5-f]喹喔啉（2-amino-3，4，8-trimethyl-3H-imidazo[4，5-f]quinoxaline，4，8-DiMeIQx）2 種HAAs也被檢出。郭海濤[19]研究表明，當鹵煮時間由1 h延長為6 h，醬鹵羊肉中的HAAs含量由51.07 ng/g升高至120.32 ng/g，且在醬鹵羊肉中共檢出5 種HAAs，其中包括IQ、4，8-DiMeIQx和2-氨基-3，8-二甲基-咪唑[4，5-f]喹惡啉（2-amino-3，8-dimethylimidazo[4，5-f]quinoxaline，MeIQx）3 種極性HAAs和Harman、Norharman 2 種非極性HAAs，且鹵煮時間的延長會導致大量Harman和Norharman的生成。

楊瀟[27]針對不同鹵煮時間條件下HAAs的產生進一步研究發現，鹵煮2 h為加工關鍵點，鹵煮時間小于2 h時，HAAs含量的上升趨勢不顯著，而當鹵煮時間大于2 h后，HAAs含量將呈現倍數增長趨勢。目前研究認為，鹵煮次數和時間的增加導致HAAs種類及含量上升的原因可能是醬油等調味料在高溫下與肉的反復作用、氨基酸的熱降解作用、反復鹵煮使得鹵汁中出現了更多有利于HAAs形成的前體物質等[26]。

2.3 前體物質

HAAs的形成往往需要一定濃度的前體物質及合適的物質的量比，前體物質含量在不同原料肉品種及同一原料肉品種不同部位間都存在巨大差異性。肌酸、肌酸酐、糖類和氨基酸等都可作為HAAs形成的前體物質，目前主要通過構建模擬體系來研究不同前體物質對HAAs形成的影響。

肌酸、肌酸酐的存在對HAAs的產生有一定促進作用[28]。而糖類在低含量時會促進HAAs產生，高含量則會抑制HAAs產生，這一現象可能是美拉德反應作用的結果，糖在低含量條件下會加速非酶褐變反應，而在高含量條件下則會加快美拉德焦糖化反應[29]。同時，氨基酸的存在種類及含量也會影響不同種類HAAs的形成。

潘晗[3]將羊肉作為醬鹵加工原料，添加不同含量的肌酸、葡萄糖、苯丙氨酸及色氨酸等前體物質，探究其對醬鹵羊肉中β-咔啉類HAAs產生的影響，得出結論：隨著色氨酸含量增加，β-咔啉類HAAs含量出現同步增加;而隨著葡萄糖含量的不斷升高，醬鹵羊肉及肉湯中β-咔啉類HAAs含量則呈現先升高后下降的趨勢;肌酸在低含量條件下會促進醬鹵羊肉及肉湯中2 種HAAs的形成;苯丙氨酸添加量1.2 mmol/L時能顯著增加Norharman、Harman含量，其余添加量條件下對Norharman、Harman的形成無顯著影響。

2.4 外源添加物

2.4.1 調味料

目前研究發現，通過添加各種調味料可以影響醬鹵肉制品中HAAs的產生。紅酒能夠抑制MeIQx和PhIP生成，但是會導致Harman形成增多[30]，而鹽、白砂糖、醬油[3]、料酒[26]等在不同添加量條件下會不同程度影響HAAs的產生種類及含量。潘晗[3]通過分析醬鹵羊肉中HAAs含量得出結論，醬油及醬肉中都存在大量非極性HAAs，其中Norharman和Harman 2 種HAAs含量最多，它們中約有50%來源于醬油，15%～23%來自于羊肉加工過程中自身發生的熱降解反應，剩余27%～31%來自于醬油與羊肉之間發生的反應。糖作為一種重要的調味料會對HAAs的形成產生影響，不同種類及添加量的糖會產生不同的作用效果，研究表明，添加低聚糖和菊粉可能是減少熟牛肉餅中雜環芳香烴形成的有效方法[31-32]。研究人員在針對烤肉中添加糖分影響HAAs生成的研究中發現，蔗糖、葡萄糖、果糖、蜂蜜均可以達到降低HAAs生成量的效果，其中蔗糖的抑制作用較其他3 種糖表現不夠理想;同時提出還原糖α-二羰基化合物的降解產物通過與PhIP及其主要前體反應，在抑制PhIP的形成中起重要作用[33]。

2.4.2 香辛料

在醬鹵過程中加入一些天然香辛料不僅可以賦予肉制品特殊風味，還能延長保質期，抑制腐敗菌的生長。香辛料中化學成分復雜，含有多種活性成分及抗氧化劑，同種香辛料對于不同種類HAAs的作用效果不同，且同種香辛料在不同添加量時可能對HAAs的作用效果也不同。

香辛料中不同成分對HAAs的作用機理也有所區別。洋蔥、大蒜中含有豐富的含硫化合物，其含有的大蒜素、二烯丙基硫化物、二烯丙基二硫化物、二丙基二硫化物等物質能參與到美拉德反應中，抑制HAAs產生[34]。香辛料中含有的部分酚類物質通常能夠捕獲反應性HAAs形成所需的羰基、清除自由基，從而抑制HAAs形成[35]，也存在一部分酚類物質能夠轉化為充當反應性羰基的醌[36]，促進HAAs形成[37]。酚類物質中的姜黃素、槲皮素和蘆丁主要通過抑制羰基化合物、3S-1，2，3，4-四氫-β-咔啉-3-羧酸形成以及清除β-咔啉類HAAs來抑制HAAs形成，而綠原酸主要通過清除β-咔啉類HAAs和氧氣來抑制HAAs形成[38]。一些辣椒、花椒、黑胡椒中存在的酰胺類物質可以通過清除中間體抑制HAAs的形成[39]。部分香辛料對醬鹵肉制品中HAAs的作用效果如表1所示。

2.4.3 其他添加物

除上述添加物之外，天然抗氧化劑（如胡蘿卜素、維生素等[40]）、合成抗氧化劑（如丁基羥基茴香醚、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚、沒食子酸丙酯等[41]）、天然果蔬提取物、中草藥提取物等植物類提取物（如洋蔥水提物[42]、葡萄籽提取物[43]、蘋果皮提取物[44]、石榴籽提取物[45]、菊花提取物[46]、綠茶提取物等）以及橄欖油、葵花籽油及葡萄籽油等[47]富含多不飽和脂肪酸的食用油，均能夠有效抑制食品中發生的致突變作用，含有多種活性物質，可在一定程度上清除自由基，從而減少HAAs的產生。除此之外，保水性物質，如微晶纖維素、羧甲基纖維素[48]、殼聚糖等[49]，通過減少食品中水分的損失減少前體物質隨水分遷移現象的發生，也能夠有效抑制HAAs的產生。

3 肉制品中HAAs的分離檢測技術

肉制品基質復雜、存在大量干擾物質以及HAAs自身的低檢出限等都給HAAs的分離檢測造成了困難，為了方便檢測，需要對HAAs進行提取、純化和濃縮等前處理，從而保證檢測準確性，目前HAAs的前處理和檢測方法較為復雜，一些具有針對性、高效率、高靈敏性的技術也在不斷出現。下面對現有的肉制品中HAAs分離及檢測方法進行介紹。

3.1 肉制品中HAAs分離提取技術

3.1.1 液-液萃取（liquid-liquid extraction，LLE）和固相萃取（solid-phase extraction，SPE）

LLE和SPE是比較經典和傳統的前處理方法，LLE主要根據溶劑之間的溶解度或分配系數不同，采用無機、有機溶劑或2 類溶劑共同作用使得絕大部分HAAs從一種溶液中轉移到另外一種溶液中進行萃取。SPE通常被認為比LLE更具有優勢，此方法分析的靈敏度和選擇性可以通過使用不同的吸附劑和洗脫劑來進行優化[2]。除一些常見的吸附劑，如硅藻土、人造絲、藍棉、丙基磺酸柱、強陽離子交換（strong cation exchange，SCX）柱、C18反相柱、Lichrolut EN（樹脂型吸附劑）等之外，目前磁性碳納米管[50]、石墨烯復合材料[51]等作為新型吸附劑，可進一步優化HAAs的提取效果。

3.1.2 固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）

為解決傳統LLE、SPE技術存在的局限性，近年來也出現了微萃取技術。SPME技術與SPE的區別在于沒有將待測物全部萃取，其原理是使樣品基質在覆蓋熔融石英纖維的有機聚合物相與水相之間建立起吸附/溶解-解吸的平衡分配。因此，纖維涂層對于目標分析物的提取非常重要。SPME是一種可忽略萃取溶劑的微萃取新技術，因其具備高度兼容性及可行性等特點越來越受到關注。Martín-Calero等[52]采用1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽離子液體作為解吸溶劑，使用CW-TPR商品涂層對試樣進行富集，同時能夠降低有機溶劑的消耗量，進而實現豬肉中Trp-p-1、Trp-p-2、AαC、2-氨基-3-甲基-9H-吡啶并[2，3-b]吲哚（2-amino-3-methyl-9H-pyrido[2，3-b]indol，MeAαC）、Harman和Norharman的分離和富集。但SPME技術目前商品化纖維涂層選擇性不高，因此，此技術還有待進一步研究。Zhang Qianchun等[53]開發了一種在線SPME-高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）技術，用于食品中HAAs的痕量分析，該方法制備了乙烯基苯基硼酸-共聚乙二醇二甲基丙烯酸乙二醇酯聚合物整體填料，可進行在線高效萃取，并采用大體積進樣來提高檢測靈敏度，顯示出良好的滲透性、提取能力和選擇性，色譜柱的重現效果令人滿意，該方法作為新型SPME技術已成功應用于烤牛肉和烤羊肉中HAAs的分析。

3.1.3 微波輔助萃取（microwave-assisted extraction，MAE）

MAE是將樣品在微波場中進行加熱，通過加熱進一步實現對物質的分化提取，將樣品中存在的微波能轉化為熱能，實現對HAAs的分離萃取。目前MAE技術常與分散液-液微萃取（dispersive liquid-liquid microextraction，DLLME）技術聯用，Aeenehvand等[54]在微波輔助條件下，用NaOH溶液、乙醇和丙酮混合溶液提取HAAs，去除蛋白質并調節pH值后，立即將樣品溶液用于DLLME工藝，甲醇和1-辛醇分別用作分散溶劑和萃取溶劑。研究人員提出了一種MAE低密度溶劑微萃取法，與HPLC聯用，并采用中心復合設計[2]、響應面設計[55]等手段對每個參數值進行優化，目前已經成功應用于燒烤及炸雞制品中HAAs的測定。

3.1.4 DLLME

DLLME是將包含分散性（水-有機混溶溶劑）和萃取性（有機溶劑）溶劑的混合物快速添加到含有目標分析物的水溶液中，會促進混濁溶液的形成。由于兩相之間形成的表面積非常大，因此被分析物可以快速、有效地富集在萃取溶劑中[11]。Vichapong等[56]采用表面活性劑輔助DLLME與HPLC技術，對肉制品中的2-氨基-3，4-二甲基咪唑并[4，5-f]喹啉（2-amino-3，4-dimethylimidazo[4，5-f]quinoline，MeIQ）、4，8-DiMeIQx、PhIP、Harman 4 種HAAs進行分析檢測，將十二烷基硫酸鈉用作離子選擇及分散劑，以1-辛醇為萃取溶劑，發現該方法對所有化合物的檢出限均為0.01 μg/kg。研究人員開發了離子液體輔助DLLME技術，可用于測定8-MeIQx，此方法將銀納米顆粒（AgNP）修飾的絲網印刷碳納米纖維作為電極，利用電化學方法進行檢測，檢出限為5 μg/L[57]。

3.1.5 其他分離提取方法

除上述幾種較為常見的分離方法外，在線串聯LLE-SPE、超臨界流體萃取（supercritical fluid extraction，SFE）、加壓液體萃取[58]、加速溶劑萃取[59]、微固相萃取（micro-SPE）[60-61]及QuEChERS[62]、電膜萃取[63]也被用來提取HAAs。Vichapong等[64]使用新一代濁點萃取程序——空氣攪拌濁點萃取（air-agitated cloud-point extraction，AACPE），用于萃取和預濃縮4 種HAAs（MeIQ、4，8-DiMeIQx、PhIP、Harman），此方法已成功應用于高預濃縮因子分析物的分析。微波輔助鹽酸法從乳糖中合成了短碳點的熒光水溶性碳納米顆粒，是新出現的一種納米技術，其可替代色譜分析前的優化萃取過程，合成納米顆粒成本廉價、具有熒光特性，通過對碳點熒光的猝滅作用以及存在HAAs時碳點的壽命進行進一步測定，此方法同樣也是目前研究HAAs定量的先進手段[65]。部分可用于分離提取肉制品中HAAs的技術條件及其優缺點如表2所示。

3.2 肉制品中HAAs檢測技術

3.2.1 LC及LC-質譜（mass spectrometry，MS）聯用法

HPLC是一種較為理想的HAAs測定方法，但是其靈敏度主要取決于組合的檢測設備，HPLC是將不同比例的混合溶劑或極性不同的單一溶劑、緩沖液等流動相裝入固定相色譜柱，同時采用高壓輸液系統，采用一定檢驗標準進行定量及定性分析。

HPLC-MS是目前檢驗手段中發展較為迅速的一種，其結合了LC技術對熱不穩定性、高沸點物質的高效分離能力以及MS技術對復雜組分的分析能力，是一種分析復雜有機混合物的有效手段，同時MS的應用也能夠進一步避免假陽性、假陰性結果的出現。Lee等[66]采用HPLC-MS/MS法對7 種不同食品基質中HAAs進行分析檢測，用6 種同位素標記的內標進行定量，使用Chem Elut和Oasis親水親脂平衡盒進行樣品制備，以消除干擾。Kwak[67]將同位素稀釋液LC-MS/MS法用于分析及定量檢測魚基質中存在的HAAs。Toribio等[68]采用低耗時的固相萃取程序純化樣品，并使用LC-MS/MS和離子阱質量分析儀作為測定技術，分析測定烤牛排中的15 種HAAs含量。Linghu等[69]使用EMR-脂質吸附劑和鹽析分配進行快速分散固相萃取，體積分數分別為1%和2%的乙腈-甲酸可從不同肉類基質中有效提取HAAs，并且結合HPLC-MS技術定量及定性分析HAAs。

超高效液相色譜-串聯質譜（ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS）是在傳統HPLC的基礎上進一步改進，采用1～2 μm的細粒徑填料和細內徑色譜柱，可以獲得很高的柱效。目前MS[70]、電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）[71]、大氣壓化學電離（atmospheric-pressure chemical ionization，APCI）[72]等技術可以輔助UPLC進行HAAs檢驗分析，提高其靈敏性和準確度。Manful等[73]使用甲醇作為溶劑的加壓加速溶劑萃取劑萃取HAAs，然后添加內標并通過UPLC-高分辨率質譜定量檢測HAAs，該方法與傳統檢測技術相比更加快速、準確、可重現，且不需要復雜的預處理步驟。Yan Yan等[74]提出采用乙腈法提取肉制品中的HAAs，并通過一步式Oasis MCX Cartridge固相萃取柱對樣品進行純化，結合UPLC-MS法可實現17 種HAAs的同步提取，乙腈法的回收率可由傳統法的32.7%～78.5%提高到42.5%～99.0%，且相對標準偏差低于傳統法，由此得出乙腈法具備更高的回收率和更好的重復性。

3.2.2 氣相色譜（gas chromatography-based methods，GC）及GC-MS法

GC法多用于分析低極性或非極性HAAs，由于HAAs多屬極性、難揮發類物質，通常需要經過衍生處理增加HAAs的揮發性，才能達到較易吸收的效果，由此提出了酰基純、烷基化、硅烷化等衍生化技術手段，應用于HAAs檢測的前處理優化。由于GC儀無法有效檢測到低含量HAAs，衍生化過程耗時且只有少部分HAAs經過衍生處理后能采用GC方法檢測，所以使用范圍較小，不是一種常用的HAAs分析方法。

GC-MS法充分結合了GC技術對復雜物質的高效分離能力以及MS技術的定性、定量、高效分析鑒定能力。研究發現，耐壓多樣品微量衍生反應裝置可用于GC-MS中，分析極性HAAs[75]，采用N-（叔丁基二甲基硅烷基）-N-甲基三氟乙酰胺（含1%叔丁基二甲基氯硅烷）硅烷化試劑，在高溫條件下衍生極性HAAs，此方法既能夠實現多個樣品同時衍生的需求，又能夠在高于試劑沸點溫度下實現衍生反應。GC-MS相比于LC-MS還需衍生步驟，較為繁瑣，操作難度較大，近些年不太用于HAAs的檢測。

3.2.3 毛細管區帶電泳（capillary zone electrophoresis，CZE）法

CZE法是以毛細管為通道、高壓電場為主要動力的一種液相分離分析技術，其發展使得分析儀器更加便攜化、集成化與微型化。Fei Xiaoqing等[76]使用CZE方法分析肉基質中的8 種HAAs，得到HAAs的最佳分離條件：以pH值為2.20的5 mmol/L甲酸-甲酸銨溶液作為運行電解質，施加18 kV電壓，采用固體萃取操作進行凈化處理，紫外（ultraviolet，UV）-二極管陣列檢測器（diode array detector，DAD）檢測，檢測波長214 nm。CZE-MS技術將MS技術的高選擇性和高靈敏度優勢與CZE的高效檢測分離優勢相結合[77]，針對食品中存在的微量復雜HAAs進行分離檢測，具備獨特優勢，十分具有發展前景。此外研究人員將毛細管高效液相色譜（CHPLC）與DAD[78]、MS[79]聯用，分析食品中的Harman、Norharman和MeIQx等HAAs。

3.2.4 酶聯免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法

ELISA是一種基于免疫學反應、可通過抗原抗體結合進行檢測的高靈敏性技術，目前可應用于分析檢驗加工肉制品中的HAAs，可分為間接競爭ELISA法和直接競爭ELISA法。Sheng Wei等[80]采用直接競爭ELISA法對HAAs進行檢測，將牛特異性多克隆抗體血清白蛋白作為免疫原，測定半數最大抑制濃度（IC50）和檢出限，發現對IQ類HAAs具有很強的特異性。王靜等[81]通過ELISA法實現了對目標物4，8-DiMeIQx的高效檢測，未來仍可進一步開發此方法在檢測HAAs中的應用，為加工肉制品中的HAAs測定提供一種簡便、快速的方法。

3.2.5 高效薄層色譜（high-performance thin-layer chromatography，HPTLC）法

除了上面幾種常用的檢驗HAAs的方法，HPTLC法也可用于檢驗HAAs，其采用粒度分布很窄的微粒硅劑（5～10 μm）制備高效薄層板，用程序多級展開或圓形展開技術使薄層色譜的靈敏度和分辨率大大提高，分析成本低、干擾小、操作簡單，但是準確度較HPLC低，且存在費時、對目標物造成污染等風險，所以現階段測定肉制品中的HAAs較少使用此方法[82]。表3總結了一些可用于檢測肉制品中HAAs的技術手段及其優缺點。

綜上所述，每種分離提取和檢驗方法都存在其相應優勢、局限性及適用對象，應根據具體的實驗對象、實驗條件及在檢出限要求下選擇合適的方法，才能準確、高效得到實驗結果，為今后的實驗提供科學的理論支撐。

4 結 語

基于醬鹵肉制品中存在的痕量HAAs物質對人體造成的遠期危害性，本文對其形成機理、影響因素進行總結。但目前國內外缺乏醬鹵肉制品中HAAs的相關研究，醬鹵肉制品中許多HAAs形成機制尚未完全明確，其安全問題并未得到重視，且我國對于HAAs在各類食品中的含量標準未作明確限制要求。同時本文針對目前用于分離檢測肉制品中HAAs的技術進行分析及評估，但HAAs的痕量水平及食品基質的高度復雜性仍給HAAs研究帶來了巨大困難，且我國的分離檢驗技術發展相對緩慢和固定化。今后，應在進一步探究HAAs形成機理的同時開發適宜的分離檢驗技術，從而采取合適的抑制手段，提高食品的安全性。

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