縫隙連接傳遞傷害性信號促進小鼠肝缺血再灌注損傷及細胞凋亡

黃菲?肖翠翠?王敏學?周少麗

【摘要】目的 探討細胞縫隙連接（GJ）信號傳遞對肝缺血再灌注損傷（HIRI）及細胞凋亡的影響。方法 C57BL/6小鼠建立HIRI模型，隨機分為假手術組（Sham組）、HIRI組、HIRI+2-氨基乙基聯苯基硼酸酯（2APB）組、HIRI+維甲酸（RA）組。HIRI+2APB組及HIRI+RA組在造模前腹腔注射2APB或RA。采用HE染色觀察肝組織病理損傷情況，生化檢測血清ALT和AST評估肝功能情況，蛋白免疫印跡法檢測凋亡相關蛋白Bim、Bax、Caspase-3的表達，TUNEL法檢測肝組織細胞凋亡情況。結果 與HIRI組相比，HIRI+RA組肝損傷及凋亡明顯增加，Bim介導的凋亡蛋白表達增強（P均< 0.05）;相反，HIRI+2APB組可顯著減輕肝損傷及細胞凋亡，并減少Bim介導的凋亡蛋白表達（P均< 0.05）。結論 GJ傳遞傷害性信號可能在HIRI進展中發揮重要作用。

【關鍵詞】肝缺血再灌注損傷;凋亡;縫隙連接

Gap junction-mediated harmful signal transmission contributes to liver injury and cell apoptosis after hepatic ischemia-reperfusion Huang Fei， Xiao Cuicui，Wang Minxue， Zhou Shaoli. Department of Anesthesiology， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China

Corresponding author， Zhou Shaoli， E-mail： 6216833@ qq. com

【Abstract】Objective To evaluate the effect of gap junction （GJ）-mediated signal transmission on liver injury and cell apoptosis after hepatic ischemia reperfusion （HIRI）. Methods C57BL/6 mouse models of HIRI were established. All animals were randomly divided into the sham operation group （Sham group）， HIRI group， HIRI+2-aminoethyldiphenyl borate （2APB） group and HIRI+retinoic acid （RA） group， respectively. In the HIRI+2APB and HIRI+RA groups， the animals were intraperitoneally injected with 2APB or RA before the establishment of HIRI models. The pathological injury of liver tissues was observed by HE staining. The liver function was evaluated by biochemical detection of serum ALT and AST levels. The expression levels of apoptosis-related proteins， such as Bim， Bax and Caspase-3 in liver tissues was quantitatively measured by Western blot. The cell apoptosis of liver tissues was detected by TUNEL assay. Results Compared with the HIRI group，the liver injury induced by HIRI and the cell apoptosis were aggravated and the expression level of Bim-mediated apoptosis-related protein was remarkably up-regulated in the HIRI+RA group （all P < 0.05）. In the HIRI+2APB group， hepatic injury and cell apoptosis were significantly alleviated and the expression level of Bim-mediated apoptosis-related protein was remarkably down-regulated （all P < 0.05）. Conclusion The harmful signal transmitted by GJ may play an important role in the development of HIRI-induced liver injury.

【Key words】Hepatic ischemia reperfusion injury;Apoptosis;Gap junction

肝缺血再灌注損傷（HIRI）常見于肝移植、肝部分切除術、失血性休克等諸多過程中，可引起肝功能不全、肝衰竭甚至多器官功能衰竭。據報道，肝部分切除術后肝功能不全發生率約9.5%，是術后患者恢復延遲和死亡的主要原因[1]。HIRI機制復雜并具有多元化特點，目前尚未完全闡明。目前研究認為凋亡是肝缺血再灌注后早期肝損傷的主要形式[2]。Bcl-2家族在凋亡的調控中起著關鍵作用， 促凋亡蛋白Bim是近年來發現的Bcl-2家族中BH3-only亞家族的一員，也叫前凋亡蛋白，它是凋亡執行所必需的上游調節因子[3]。

細胞縫隙連接（GJ）是細胞間直接聯系通道，允許分子量小于1 KDa的物質在相鄰細胞間雙向性流動。GJ的信號傳遞在維持細胞內環境穩定和器官功能、調控細胞生長發育等過程中扮演重要角色[4]。GJ介導“旁細胞效應”被很多科學家形象地將其稱為“死亡之吻”，并受到了科研界的廣泛關注，因為這使對繼發損傷程度的限制成為可能[5]。肝細胞間的GJ十分豐富，肝細胞主要表達Cx32和少量的Cx26，GJ發揮著重要的生理功能[6]。我們團隊前期體外實驗發現，缺氧復氧誘導BRL-3A肝細胞凋亡與Cx32組成的GJ通訊增強有關[7]。因此我們提出假設：Cx32組成的GJ傳遞傷害性信號可能加重HIRI。本研究旨在初步探討Cx32組成的GJ在HIRI中的作用，為以GJ為靶點早期干預肝損傷進展提供實驗依據。

材料與方法

一、材 料

SPF級健康雄性C57BL/6小鼠28只（8 ～ 10周，20 ～ 25 g）購于廣東省動物實驗中心;2-氨基乙基聯苯基硼酸酯（2APB）及維甲酸（RA，Sigma，美國）;Bim、Bax、Caspase-3單克隆抗體（Invitrogen，美國）;HRP標記的兔抗小鼠IgG抗體（Sigma，美國）;TUNEL檢測試劑盒（Roche，美國）。

二、方 法

1. 70%小鼠HIRI模型

本研究中所有動物實驗均通過中山大學附屬第三醫院實驗動物倫理委員會批準。根據我們既往經驗，按照我們既往發表文獻[8]的方法建立小鼠70%肝缺血再灌注模型。具體操作步驟如下：①術前常規禁食8 h，自由飲水;②氯胺酮（60 mg/kg）

復合甲苯噻嗪（100 mg/kg）復合液腹腔注射進行麻醉;③手術取仰臥位，腹部備皮、消毒后腹部正中切口入腹;④進入腹腔后仔細游離進入肝左葉和肝中葉的血管;⑤使用無損傷的微血管夾阻斷供應上述兩個肝葉（缺血肝葉）的動脈和靜脈，并保留供應肝臟尾狀葉、右葉、乳頭狀葉及方葉的血流防止腸靜脈充血;⑥缺血期間腹部傷口以濕潤紗布覆蓋，在進行60 min缺血后（觀察缺血肝葉的顏色變化，顏色變灰白證明缺血成功），小心松開微血管夾，開始進行再灌注（再灌注后缺血肝葉顏色變化粗略判斷再灌注成功）。仔細止血后，連續全層縫合腹壁切口關腹。實驗過程中注意實驗室的溫度控制在30℃左右，并盡量減少出血。

2.實驗動物分組

實驗選取SPF級健康雄性野生型C57BL/6小鼠28只，隨機分為假手術組（Sham組）、HIRI組、肝缺血再灌注+縫隙連接抑制劑（2APB）預處理組（HIRI+2APB組）、肝缺血再灌注+縫隙連接增強劑（RA）預處理組（HIRI+RA組）。假手術組在麻醉后只進行腹腔開腹和血管的分離，不進行肝臟的阻斷和灌注。HIRI+2APB組及HIRI+RA組在造模前腹腔注射2APB（20 mg/kg，0.5 ml）或RA（10 mg/kg，0.5 ml）。

3. 標本的采集和處理

各組在肝臟再灌注后6 h采集標本。再次麻醉小鼠，并從下腔靜脈取血0.5 ～ 1.0 ml，以1500轉/分

的速度離心后提取上清液，分裝注入已編號標記好的EP管中，置入-20℃冰箱保存，用于后續的肝功能生化檢測。收集缺血肝葉，部分肝組織用4%多聚甲醛溶液固定24 h，常規石蠟包埋、切片，HE染色，用于肝組織病理學檢測;剩余肝組織放入凍存管后立即置入液氮中保存，并在實驗完畢后迅速轉運置入-80℃深低溫冰箱進一步保存，用于后續的肝組織相關蛋白檢測。

4. 肝損傷病理學評分標準

選取切片平整、組織細胞形態和結構清晰的HE染色組織切片進行光鏡下觀察和分析。參照Suzuki評分法對肝損傷程度進行病理學評分，具體評分標準如下：0分，無損傷， 肝實質與間質正常;1分，輕微病變，肝竇間隙輕微充血，很少空泡形成及單個肝細胞壞死;2分，肝竇間隙輕度充血，少數空泡形成，小于30%的肝細胞壞死;3 分，中度損傷，肝竇間隙中度度充血，中度空泡形成，約30% ～ 60%的肝細胞壞死;4分，嚴重損傷，肝竇間隙嚴重充血，重度空泡形成，超過60%的肝細胞壞死[9]。

5. 蛋白免疫印跡法檢測蛋白表達

取缺血肝葉肝組織冰浴中充分勻漿（加入裂解液），于4℃、12 000轉/分離心30 min，二辛可寧酸（BCA）法蛋白定量，每份樣品各取25 μg蛋白質。配膠、電泳，轉膜后封閉2 h，加入β-actin（兔抗小鼠，1∶3000）、Cx32（兔抗小鼠，1∶1000）、Bim（兔抗小鼠，1∶1000）、Bcl-2（兔抗小鼠，1∶1000）、Caspase-3（兔抗小鼠，1∶1000）一抗，4℃搖床孵育過夜，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗膜3次，每次10 min。加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG? （1∶5000）? 室溫搖床孵育后PBS洗膜，暗室中曝光、顯影，采用Image J軟件檢測β-actin及目的蛋白條帶的灰度值，以目的蛋白條帶灰度值/β-actin蛋白條帶灰度值作為目的蛋白表達量。將3張以上條帶灰度值平均值作為本次實驗結果。

6. TUNEL法檢測肝組織細胞凋亡

厚度3 μm的組織切片37℃溫箱烘烤過夜→脫蠟及水化→3%的雙氧水甲醇溶液37℃恒溫箱孵育10 min（TBS洗3次，每次5 min）→蛋白酶K滲透，37℃恒溫箱孵育10 min（TBS洗3次，每次5 min）→滴加標記緩沖液，37℃恒溫箱孵育2 h

（TBS 洗3次，每次5 min）→封閉液封閉，室溫孵育30 min→滴加TUNEL反應液到組織上，37℃恒溫箱孵育30 min（TBS洗3次，每次5 min）→滴加POD轉化劑到組織上，37℃恒溫箱孵育30 min（TBS洗3次，每次5 min）→DAB顯色→蘇木素復染細胞核90 s，充分水洗、脫水、透明及中性樹脂封片→數據分析。

三、統計學處理

采用Sigmaplot 10.0分析數據。實驗數據以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P < 0.05為差異有統計學意義。

結果

一、肝損傷及評分

我們在光鏡下觀察肝組織HE染色切片，結果顯示，假手術Sham組肝組織形態和結構基本正常，未見明顯肝竇充血和肝細胞壞死;肝缺血6 h后（HIRI組）肝組織病理損傷嚴重，可見肝竇明顯充血，肝細胞腫脹、空泡形成，炎性細胞浸潤，并出現片狀壞死，見圖1A。各組Suzuki評分在統計學上存在差異（F = 54.33，P < 0.05）。與HIRI組相比，HIRI+RA組小鼠肝組織病理學損傷進一步加重，壞死區域面積擴大，Suzuki評分升高（P < 0.05）。相反，與HIRI組相比，HIRI+2APB組小鼠肝組織病理學損傷明顯減輕，肝竇充血和肝細胞腫脹減少，壞死區域面積縮小，Suzuki評分有所降低（P < 0.05），表現出肝損傷的好轉，見圖1B。

二、肝功能情況

各組小鼠血清ALT和AST水平存在差異（F值分別為147.9和86.05，P 均< 0.05）。與Sham組相比，HIRI組小鼠血清ALT水平升高（P < 0.05），提示存在明顯的肝細胞損傷;與HIRI組相比，HIRI+RA組小鼠血清ALT水平進一步升高（P < 0.05），提示肝細胞損傷進一步加重;相反，HIRI+2APB組ALT水平下降（P < 0.05），表現出肝功能的保護作用，見圖1C。各組小鼠血清AST水平變化與ALT呈現相同的趨勢，見圖1D。

三、肝組織中凋亡相關蛋白Bim、Bax、Caspase-3表達

各組小鼠肝組織Bim、Bax和Caspase-3蛋白表達存在差異（F值分別為63.15、36.61和35.65，P 均< 0.05）。與Sham組相比，HIRI組小鼠肝組織Bim、Bax、Caspase-3蛋白表達上調（P 均< 0.05），與HIRI組相比，HIRI+RA組Bim、Bax和Caspase-3蛋白表達進一步上調（P均< 0.05），相反，HIRI+2APB組上述蛋白表達有所下降（P均< 0.05），見圖2。

四、肝組織中細胞凋亡情況

與Sham組相比，HIRI組小鼠肝組織細胞凋亡明顯增加;與HIRI組相比，HIRI+RA組細胞凋亡進一步增加;相反，HIRI+2APB組細胞凋亡明顯減少，見圖3。

討論

本研究所使用的模型為70%HIRI模型，這是目前非常成熟的非致命性肝臟熱缺血再灌注損傷模型，國內外大量研究均以此模型來模擬肝臟缺血再灌注過程而進行HIRI方面的研究[10]。我們團隊前期研究觀察了C57BL/6小鼠肝缺血1 h后不同時間點肝損傷情況的動態變化，發現再灌注6 h肝損傷最重[11]。據此，我們在本次研究中，采用肝缺血1 h再灌注6 h作為模型。

肝組織細胞中的GJ十分豐富，其中Cx32是肝臟中表達最多的Cx蛋白，占肝組織Cx蛋白總量的90%以上[12]。本研究結果顯示，使用GJ增強劑可加重肝損傷及細胞凋亡，相反，使用GJ抑制劑可明顯減輕肝損傷和細胞凋亡，提示在HIRI過程中，GJ可能傳遞傷害性信號放大損傷和凋亡。那么，究竟是哪一種Cx蛋白組成的GJ發揮的作用呢？目前認為，2APB是Cx32特異性的GJ抑制劑，只對Cx32組成的GJ功能有抑制作用，對其他Cx蛋白組成的GJ無影響，那么，我們的結果提示Cx32組成的GJ在此過程中可能發揮了重要作用[13]。

在細胞凋亡的進程中， 有兩個家族的蛋白質起到非常重要的作用：Caspase家族是凋亡的執行者，而Bcl-2家族則為凋亡的決策者。Bcl-2家族又分為抗凋亡的Bcl-2亞家族及促凋亡的Bax和BH3-only亞家族。BH3-only亞家族被認為是Caspase級聯反應的啟動者[14]。在BH3-only亞家族成員中，Bim是目前已知最重要的促凋亡因子，因為它不僅可激活多種Bcl-2家族的促凋亡蛋白，還可與該家族中幾乎所有抗凋亡蛋白結合抑制其作用[15]。有學者報道，Bim在內質網應激誘導的細胞凋亡中扮演不可或缺的哨兵角色，是上游死亡信號級聯反應和下游Bax/Bak依賴的線粒體凋亡程序的連接者[16]。在造血細胞、腎臟上皮細胞、黑素細胞、神經細胞、干細胞以及自身免疫性胸腺細胞中的研究證明，Bim是凋亡最關鍵的始動因子，在其凋亡過程中必不可少[17-18]。本研究結果顯示，通過GJ工具藥改變GJ功能可以明顯影響Bim及下游凋亡蛋白Bax的表達，提示GJ參與Bim介導的凋亡，但GJ究竟傳遞何種信號，通過何種途徑促進Bim表達，還需要進一步的研究。

本實驗證實了改變GJ功能可以明顯影響HIRI程度和細胞凋亡數量，并改變Bim介導的凋亡相關蛋白的表達，其機制可能與GJ傳遞傷害性信號有關，但此傷害性信號的性質尚不清楚，值得深入研究，為以GJ為靶點，減輕HIRI提供實驗依據。

參 考 文 獻

[1] 彭娜，王彥峰，何維陽，李明霞，胡曉燕，葉啟發.肝移植供肝缺血再灌注損傷的研究進展.中華肝膽外科雜志，2016，22（5）：349-351.

[2] 王冰，林穎，劉慧玲，金海，汪根樹，吳斌，陳規劃.己酮可可堿對大鼠肝臟缺血再灌注損傷的影響.新醫學，2011，42（8）：601-604.

[3] Sionov RV， Vlahopoulos SA， Granot Z. Regulation of bim in health and disease. Oncotarget，2015，6（27）：23058-23134.

[4] Maes M， Crespo Yanguas S， Willebrords J， Cogliati B， Vinken M. Connexin and pannexin signaling in gastrointestinal and liver disease. Transl Res，2015，166（4）：332-343.

[5] Suzuki M. Significance of radiation-induced bystander effects in radiation therapy. Igaku Butsuri，2014，34（2）：70-78.

[6] Patel SJ， Milwid JM， King KR， Bohr S， Iracheta-Vellve A， Li M， Vitalo A， Parekkadan B， Jindal R， Yarmush ML. Gap junction inhibition prevents drug-induced liver toxicity and fulminant hepatic failure. Nat Biotechnol， 2012，30（2）：179-183.

[7] Wang R， Huang F， Chen Z， Li S. Downregulation of connexin 32 attenuates hypoxia/reoxygenation injury in liver cells. J Biochem Mol Toxicol，2015，29（4）：189-197.

[8] Ge M， Yao W， Wang Y， Yuan D， Chi X， Luo G， Hei Z. Propofol alleviates liver oxidative stress via activating Nrf2 pat-hway. J Surg Res，2015，196（2）：373-381.

[9] Zhang Y， Yuan D， Yao W， Zhu Q， Liu Y， Huang F， Feng J， Chen X， Huang Y， Chi X， Hei Z. Hyperglycemia aggravates hepatic ischemia reperfusion injury by inducing chronic oxidative stress and inflammation. Oxid Med Cell Longev，2016，2016：3919627.

[10] 黑子清.肝移植圍術期器官損傷機制及器官保護策略研究進展.中山大學學報（醫學版），2019，40（4）：488-492.

[11] Wu S， Yao W， Chen C， Chen H， Huang F， Liu Y， Cai J， Yuan D， Hei Z. Connexin 32 deficiency protects the liver against ischemia/reperfusion injury. Eur J Pharmacol，2020，876：173056.

[12] Masia R， Diagacomo E， Adams D， King KR， Piaker S， Reinecker HC， Yarmush ML， Argemi J， Bataller R， Dienstag JL， Chung RT， Patel SJ. Hepatic gap junctions amplify alcohol liver injury by propagating cGAS-mediated IRF3 activation. Proc Natl Acad Sci USA，2020，117（21）：11667-11673.

[13] Bai D， del Corsso C， Srinivas M， Spray DC. Block of specific gap junction channel subtypes by 2-aminoethoxydiphenyl borate （2-APB）. J Pharmacol Exp Ther，2006，319（3）：1452-1458.

[14] Huang K， O'Neill KL， Li J， Zhou W， Han N， Pang X， Wu W， Struble L， Borgstahl G， Liu Z， Zhang L， Luo X. BH3-only proteins target BCL-xL/MCL-1， not BAX/BAK， to initiate apoptosis. Cell Res，2019，29（11）：942-952.

[15] Frank DO， Dengjel J， Wilfling F， Kozjak-Pavlovic V， H?cker G， Weber A. The pro-apoptotic BH3-only protein Bim interacts with components of the translocase of the outer mitochondrial membrane （TOM）. PLoS One，2015，10（4）：e0123341.

[16] Huang DC， Strasser A. BH3-Only proteins-essential initiators of apoptotic cell death. Cell，2000，103（6）：839-842.

[17] Shukla S， Saxena S， Singh BK， Kakkar P. BH3-only protein BIM： an emerging target in chemotherapy. Eur J Cell Biol，2017，96（8）：728-738.

[18] Qian G， Yao W， Zhang S， Bajpai R， Hall WD， Shanmugam M， Lonial S， Sun SY. Co-inhibition of BET and proteasome enhances ER stress and Bim-dependent apoptosis with augmented cancer therapeutic efficacy. Cancer Lett，2018，435：44-54.

（收稿日期：2020-06-18）

（本文編輯：楊江瑜）