酒黃連HPLC特征圖譜的建立及聚類分析和主成分分析＊

康念欣，袁炎炎，張 瀟，路穎慧，李晴霞，李 飛，譚 鵬

（北京中醫藥大學中藥學院 北京市科委 中藥生產過程控制與質量評價北京市重點實驗室 北京 102400）

黃連為毛茛科植物黃連（Coptis chinensisfranch）、三角葉黃連（Coptis deltoideaC. Y. cheng et Hsiao）、云連（Coptis teetawall.）的干燥根莖，味苦、性寒，歸心、肝、胃、大腸經，具有清熱燥濕、瀉火解毒的作用[1]。黃連中主要含非洲防己堿、藥根堿、表小檗堿、黃連堿、小檗堿、巴馬汀等生物堿類成分[2]，還含有阿魏酸、綠原酸、黃柏酮、槲皮素和微量元素等非生物堿類成分[3]。

黃連的炮制首次記載于南朝劉宋時期雷敩所著的《雷公炮炙論》，有“凡使黃連，以布拭上肉毛，然后用漿水［炊粟米熟，投冷水中，浸五、六日，味酢（酸味），生白花，色類漿，故名漿水］浸二伏時，漉出，于柳火中焙干用”的記載。黃連的炮制品有生黃連、酒制黃連、姜制黃連、吳茱萸制黃連等，采用不同的輔料炮制可改變黃連的性味，從而改變其功效，如黃連經酒制后可引藥上行，緩和寒性，清頭目之火；經姜制可緩和黃連過于苦寒之性，止嘔作用增強；吳茱萸制黃連可抑制黃連苦寒之性，使其寒而不滯，清氣分濕熱[4]。

目前，對于黃連及其炮制品質量鑒別的方法學研究以指紋圖譜的研究較多,且集中于黃連不同炮制品指紋圖譜及炮制前后化學成分含量差異、變化研究。性狀量化鑒別方法主要包括電子舌[5]、電子鼻[6]等，化學成分及指紋圖譜的研究多使用高效液相色譜（HPLC）[7]、超高效液相色譜—三重四級桿串聯質譜（UPLC-MS/MS）[8]等方法。廖慶文等[9]采用 HPLC 法，研究了黃連不同炮制品的炮制機理，建立黃連六種炮制品的HPLC 圖譜，采用指紋圖譜相似度分析和聚類方法分析其結果，可將六種黃連炮制品分為兩類，表明其分類結果與藥性相關，符合傳統中醫藥理論中的“叢制”“反制”理論；有研究采用3 批黃連藥材建立了黃連片、酒黃連、姜黃連、萸黃連四種飲片的特征圖譜，測定了小檗堿、木蘭堿、巴馬汀、黃連堿、藥根堿等5 種化學成分的含量，結果顯示黃連不同炮制品間色譜峰數量和峰面積均有差異，黃連炮制前后化學成分含量發生有規律變化[10]；已有研究建立黃連片、萸黃連和姜黃連各十批飲片的指紋圖譜和紅外圖譜，對三種飲片的指紋圖譜進行聚類分析，對紅外圖譜進行主成分分析，三者的指紋圖譜和紅外圖譜相似度差異較小，分別經聚類分析、主成分分析后，可將三種飲片區分開[11]。關于結合聚類分析和主成分分析方法分析酒黃連特征圖譜的研究鮮有發現。

目前，藥品標準中黃連炮制品與黃連飲片的質量標準基本相同，使得質量控制標準模糊[12]。酒黃連為黃連的炮制品之一，在《中華人民共和國藥典》2015 年版及全國各地炮制規范中其炮制方法均為酒炙，并且《中華人民共和國藥典》中無酒黃連炮制工藝的具體工藝參數；各地方炮制規范中酒黃連輔料用量，炮制程度等存在差異，導致飲片質量不穩定。

聚類分析是將隨機現象歸類的統計學方法，即根據已知數據，計算變量與個體之間的距離或相關系數等統計量來表明不同個體與變量之間的相關性，并根據“最短距離法”“最長距離法”等法則使得同類個體差別較小，不同類個體差別較大，從而將原始數據劃分為不同的類別，類別的數目和其組成未知。主成分分析是一個正交化線性變換的過程，通過線性變換，將原始數據中多個相關指標組合成幾個綜合指標（主成分），即原始指標的線性組合，綜合指標可保留原始指標的主要信息，但互不相關，即主成分可代表原始數據，簡化分析模型。將主成分分析和聚類分析相結合的分析方法已經用于工業生產、空氣質量評價和農業等方面[13-15]，并且已應用于中藥材和中藥飲片質量評價。王悅云等[16]建立了不同產地的34 批粗毛淫羊藿的指紋圖譜，并結合聚類分析、主成分分析和因子分析評價各產地粗毛淫羊藿質量，選出其質量較好的產地為貴陽、凱里、麻江等地。有研究[17]結合聚類分析和主成分分析研究檀香13 批藥材的指紋圖譜，揮發油含量較低的S3、S4 批次的檀香歸為一類，其他批次藥材歸為一類，表明該方法可合理地評價檀香藥材質量。還有研究采用主成分分析和聚類分析方法對青皮[18]、尖尾風[19]等飲片質量進行評價。

本研究以前期實驗中優選的最佳炮制工藝（取凈黃連，加黃酒（黃酒進行稀釋1∶4）悶潤2 h，至液吸盡，(150±10)℃炒制20 min，每100 kg黃連，用黃酒12.5 kg）炮制不同批次黃連所得到的酒黃連、中試所得酒黃連以及收集得來的酒黃連為研究對象，應用HPLC 法建立酒黃連的特征圖譜，并在酒黃連的特征圖譜研究中運用聚類分析、主成分分析等方法結合處理實驗數據，對酒黃連質量進行評價，以期為酒黃連的質量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Waters 2695 高效液相色譜儀（包括2695 四元梯度泵，在線脫氣機，自動進樣器，柱溫箱，2489 紫外檢測器，Empower 色譜工作站）；超聲波清洗器（SB25-12DTDN 型，寧波新芝生物科技股份有限公司）；循環多用真空泵（SHB-3 型，鄭州長城科工貿有限公司）；BT-25S 電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）；BS210S 電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）。

1.2 試劑

鹽酸藥根堿（批號B21451，純度≥98%）、非洲防己堿（批號B20391，純度≥98%）、黃連堿（批號B20560，純度≥98%）、表小檗堿（批號B20108，純度≥98%）、巴馬汀（批號B21433，純度≥98%）、小檗堿（批號B21379，純度≥98%），購于上海源葉生物科技有限公司。乙腈和氨水（色譜純，美國Fisher 公司）；水為娃哈哈純凈水；其余試劑為分析純。

1.3 藥材

酒黃連飲片共20 批，其中S14、S15、S19、S20 為市售酒黃連，其他批次為根據優選工藝炮制的自制樣品和中試樣品，用于炮制的黃連藥材經北京中醫藥大學中藥鑒定系楊瑤君教授鑒定為毛茛科植物黃連（Coptis chinensisFranch.）的干燥根莖。各批酒黃連粉碎，過二號篩備用。酒黃連樣品來源見表1。

表1 酒黃連樣品信息

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：XtimateC18（4.6 mm*250 mm，5 μm）；流動相：A:30 mmol·L-1碳酸氫銨水溶液（1 000 mL碳酸氫銨水溶液含氨水7 mL、三乙胺1 mL），B：乙腈。乙腈梯度 洗 脫（0-12 min，10%-25%B；12-23 min，25%-30%B；23-35 min，30%-40%B；流速1 mL·min-1；檢測波長270 nm；柱溫30℃；進樣量10 μL。該條件下，基線平穩、峰形較好，分離度符合要求。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液

精密稱取藥根堿、非洲防己堿、黃連堿、表小檗堿、巴馬汀、小檗堿6 種對照品適量，置于10 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度。其中各成分濃度分別為123 μg·mL-1、122 μg·mL-1、214 μg·mL-1、123 μg·mL-1、315 μg·mL-1、413 μg·mL-1。

2.2.2 供試品溶液

按照2015 年版《中華人民共和國藥典》黃連項下含量檢測方法，精密稱取20批酒黃連粉末（過二號篩）0.1 g，置具塞錐形瓶內，精密加入甲醇∶鹽酸（100∶1）的混合液50 mL，稱定重量，密塞，超聲30 min（功率250 W，頻率40 kHz），放冷，用甲醇補足失重，濾過，濾液過微孔濾膜（0.45 μm），即得供試品溶液，備用[1]。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：D809010101），按“2.1”項下色譜條件連續進樣6 次，記錄色譜圖，將其導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”，以巴馬汀的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有色譜峰的相對保留時間和相對峰面積。結果顯示13 個共有峰的相對保留時間的RSD 值在0.04%-1.37%之間，相對峰面積的RSD 在1.21%-4.84%（n=6），表明儀器精密度符合要求。

2.3.2 穩定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：D809010101），分別在室溫下放置 0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h 時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以巴馬汀的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有色譜峰的相對相對保留時間和相對峰面積。結果顯示13 個共有峰的相對保留時間的RSD 值在0.01%-0.78%之間，相對峰面積的RSD值在1.10%-4.53%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內基本穩定。

2.3.3 重復性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：D809010101）0.1 g，共6 份，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件進樣，以巴馬汀的保留時間和峰面積為參照，計算各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積。1-13 號峰的相對保留時間的RSD 值在0.02%-0.58%之間，相對峰面積的RSD 值在1.21%-4.89%之間。表明此方法重現性良好。

2.4 HPLC特征圖譜的生成及相似度評價

2.4.1 HPLC特征圖譜的生成

取20 批酒黃連粉末，按照“2.2.2”項下方法，制備供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件進行測定。記錄色譜圖，將其導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”，分析20 批酒黃連的HPLC 色譜圖，選取分離度、峰形較好的13 個峰為共有峰，得到特征圖譜，見圖1；藥材的共有模式圖譜見圖2。8-13 號峰分別與藥根堿、非洲防己堿、表小檗堿、黃連堿、巴馬汀和小檗堿的對照品保留時間相一致（混合對照品圖譜見圖3）。

2.4.2 相似度評價

圖1 20批酒黃連的疊加特征圖譜

圖2 酒黃連對照樣品的HPLC特征圖譜

圖3 混合對照品色譜圖

以酒黃連樣品的對照特征圖譜為參照圖譜，對20批酒黃連飲片的特征圖譜進行相似度分析，分析結果見表2。20 批酒黃連樣品的相似度為0.999-1.000，各批樣品相似度差異小，表明飲片質量穩定。

2.5 聚類分析

本研究將20 批酒黃連特征圖譜13 個共有峰的峰面積做標準化處理后作為變量，利用SPSS 19.0統計分析軟件，采用系統聚類法結合歐氏距離（Euclidean distance）作為樣品的測度，進行聚類分析。通過聚類分析可得到樹狀圖，其中同組樣本相關性較高，不同組樣本相關性較小，樹狀圖可以更加直觀地分析各樣本間的相關性，結果見圖4。

由圖 4 可知，d=20 時，20 批酒黃連可以分為 2 類，S4-S13 為一類，酒黃連藥材產地為四川，S1-S3 及S14-S20 為一類，即酒黃連藥材來源為重慶和湖北的分為一類。d=18 時，20 批酒黃連樣品可以分為3 類，將產地為重慶和湖北的酒黃連區分開，在生物堿含量方面，S1、S2、S3聚為一類，生物堿含量較低；S4-S13聚為一類，生物堿含量高；S14-S20 聚為一類，生物堿含量較高。20 批酒黃連生物堿含量見表3，主要測定各批酒黃連中藥根堿、非洲防己堿、表小檗堿、黃連堿、巴馬汀、小檗堿等六種生物堿含量及總生物堿含量。聚類結果與其產地相一致，表明聚類分析可以用來區分不同產地和不同質量的酒黃連。

2.6 主成分分析

主成分分析是一個正交化線性變換的過程，通過線性變換，將原始數據中多個相關指標組合成幾個綜合指標（主成分），即原始指標的線性組合，綜合指標可保留原始指標的主要信息，但互不相關，即主成分可代表原始數據，簡化分析模型。

本研究中用SPSS 19.0 統計分析軟件將20 批酒黃連13個共有峰的峰面積做標準化處理后，以主成分的特征值和貢獻率為依據，對其進行主成分分析。主成分分析中坐標系的轉化將數據變換到新的坐標系統中，每個變量在新軸上的投影稱為其載荷，表示該軸上每個變量的相對重要性并有相關得分。為了使分析結果更加直觀，主成分分析選取3個主成分，特征值分別為9.096、2.386、0.513，累積方差貢獻率分別是69.968%、88.322%、92.271%，結果見表4。

表2 20批酒黃連樣品相似度

圖4 20批酒黃連聚類分析樹狀圖

表3 20批酒黃連生物堿含量（n=2）

表4 2個主成分的特征值和方差貢獻率

20 批酒黃連根據主成分得分 Y1、Y2、Y3作散點圖分析其聚類結果。主成分分析聚類結果見圖5，在主成分空間中距離較近的為同類樣本，距離較遠的為不同類樣本。圖5 顯示20 批酒黃連可聚為三類，S1、S2、和 S3 距離較近，S4-S13 聚在一起，S14-S20 中 S17、S18、S19 在主成分空間中比較分散，此結果與聚類分析結果較一致。

3 討論

本研究前期探究了酒黃連的較優炮制工藝。以炮制品外觀性狀和藥根堿、非洲防己堿、表小檗堿、黃連堿、巴馬汀、小檗堿等六種生物堿含量為指標綜合評分，采用正交實驗的方法，考察黃酒稀釋倍數、悶潤時間、炒制溫度、炒制時間等因素對酒黃連質量的影響，優選出酒黃連的較優炮制工藝：取凈黃連，加黃酒（黃酒進行稀釋 1∶4）悶潤 2 h，至液吸盡，（150±10）℃炒制20 min，每100 kg 黃連，用黃酒12.5 kg。經驗證實驗、中試實驗表明該工藝穩定、可行。使用該工藝炮制的酒黃連及購買的酒黃連用作本研究中的樣品。

本研究建立了酒黃連的HPLC 特征圖譜并進行相似度分析。特征圖譜的建立選擇碳酸氫銨水溶液-乙腈為流動相，梯度洗脫；檢測波長270 nm；柱溫30℃；進樣量10 μL的色譜條件，在此條件下基線平穩、峰形較好，分離度符合要求，具有較好的重復性和專屬性。HPLC 法較為全面地反應了酒黃連飲片中化學成分的信息，選取分離度較好地13 個特征峰形成特征圖譜，根據標準品對照可知8號峰為藥根堿、9號峰為非洲防己堿、10號峰為表小檗堿、11號峰為黃連堿、12號峰為巴馬汀、13號峰為小檗堿。相似度分析結果表明20批酒黃連相似度為0.999-1.000，相似度較高，20 批酒黃連飲片質量穩定。

圖5 20批酒黃連主成分分析圖

主成分分析和聚類分析是較為常用的多元統計方法，用于探索數據和分組之間的關系尚不清楚的樣本之間的相似性和隱藏模式。主成分分析（PCA）可對大型多元數據集的變量進行重組，使重構數據集的前幾個變量占數據方差的絕大部分，其目的是確定若干變量之間最重要的相關關系，以便在原始變量的基礎上用很少的線性組合描述總體方差。聚類分析方法可發現各樣本之間的相似性，根據相似性大小將樣本聚類，并生成聚類圖。聚類分析應用數據的所有方差進行分類，但會丟失每類中變量的相關關系信息；主成分分析選擇的主成分代表60%-90%的原始信息，但可表明原始數據間的相關性，與單獨使用這兩種方法相比，將主成分分析與聚類分析結合使用可以提供更多的信息[20]。

在飲片質量穩定的基礎上應用SPSS 19.0 數據處理軟件根據特征圖譜對20批酒黃連飲片聚類分析，表明聚類分析可對酒黃連進行較好地分類，分析結果為當歐式距離d=18 時，20 批酒黃連可分為三類：生物堿總含量較低的S1-S3，即產地為重慶的酒黃連聚為一類；生物堿總含量高的S4-S13，即產地為四川的酒黃連聚為一類；生物堿總含量較高的S14-S20，即產地為湖北的酒黃連聚為一類，表明基于生物堿成分含量差異評價酒黃連質量的差異與其產地有關。對酒黃連的特征圖譜進行主成分分析，共選擇了3個主成分，累積方差貢獻率達到90%以上，各批飲片在主成分空間中相距較近的為一類，主成分分析同樣將20批酒黃連分為三類：S1-S3 聚為一類；S4-S13 聚為一類；S14-S20 中 S17、S18、S19 在主成分空間中與其他批次距離較遠，主成分分析結果與聚類分析結果相近，這表明兩種分析結果的一致性和科學性。此外，聚類分析和主成分分析相結合可發揮二者的優勢，相互驗證、補充，實現快速分析。綜上所述，本研究基于聚類分析和主成分分析研究酒黃連HPLC 特征圖譜可作為酒黃連質量評價的方法和依據。