國產普通熒光定量PCR 技術與羅氏內標法熒光定量PCR 技術在HBV 檢測中的意義評價

黃麗娟 張麗芬

（江門市婦幼保健院 廣東 江門 529000）

乙型肝炎病毒已經屬于全球性的公共衛生問題，且據統計世界上有20 億患者感染過HBV 病毒，且有約350 萬人長期感染乙肝病毒，其中有5%～10%的感染者將發展為慢性病毒攜帶者，多數患者終身或者是多年攜帶乙肝病毒，后續可發展為慢性活動性肝炎，甚至出現肝硬化以及肝癌疾病，對患者的生命健康以及生活質量影響較大，因此給予該類患者及時且有效的檢測有著至關重要的作用[1]。當前臨床上診斷乙肝的常用方法為免疫學方法以及肝功能檢查法，在免疫學檢查中，有血清HBV抗體、抗原、HBV-DNA 多聚酶法等。近些年來HBV-DNA 檢測已經成為HBV 感染的直接標志，而目前用于乙肝病毒載量分析的主要方法有兩種，即國產普通熒光定量PCR 技術與羅氏內標法熒光定量PCR 技術，但是國產的普通熒光定量PCR 檢測結果與羅氏內標法熒光定量PCR 檢測結果的差異性并不明確[2]。因此本文就兩種檢測方法在乙型肝炎病毒患者中的應用效果進行研究，具體如下。

1.資料與方法

1.1 一般資料

選取我院收集的120 例HBV 患者，收集的時間為2017 年5月—2019 年5 月，對所有的標本使用國產普通熒光定量PCR 技術與羅氏內標法熒光定量PCR 技術進行檢測。其中男性血清標本70 例，女性血清標本50 例，患者的年齡18 ～75 歲，平均（46.64±2.58）歲。詳細記錄患者的年齡、性別、病史等，對兩組檢測的結果進行對比，了解國產普通熒光定量PCR 技術的檢測準確率等；再根據乙肝五項定量檢測的結果，將所有的血清標本分為HBeAg（+）組、HBeAg（-）組，再將羅氏內標法熒光定量PCR 技術檢測組的檢測結果與國產普通熒光定量PCR 技術進行差異性分析。

納入標準[3]：所有的患者符合中國2010 版“慢性乙型感染防治指南”中對HBV 的診斷標準，且被診斷為慢性乙型病毒性肝炎；所有的標本均在患者空腹時采集，且在2 小時之內進行血清分析，之后便保存于-20℃的低溫冰箱中。排除標準：采集的血液標本有溶血等現象的發生。

診斷標準[4]：患者符合以下之一者為HBV 感染，①患者原有乙型肝炎病毒感染史，且有HBsAg 攜帶史，該次就診原因為HBV 再次出現，且肝功能體征、癥狀異常；②患者面色晦暗，有蜘蛛掌、肝掌等慢性肝炎的癥狀，但是患者否認有肝炎病毒感染史；③患者經過肝臟穿刺獲取的組織學標本顯示有慢性肝炎，并且能夠排除其他原因引發的慢性肝炎疾病；④患者為急性乙型病毒性肝炎感染，且病程已經超過6 個月。

1.2 方法

國產普通熒光定量PCR 技術中，所有患者均在清晨抽取2至3 毫升空腹靜脈血，每人取3 份標本，普通離心機（廠家：背景雷博爾有限公司），普通熒光定量PCR 檢測試劑盒（廠家：上海復星長征醫學科學有限公司）；根據試劑盒的說明將模板進行提取，之后配制反應體系，進行PCR 擴增技術，在94℃預變性5 分鐘，在94℃預變性15 秒，在60℃預變性30 秒，共進行40 個循環。

羅氏內標法熒光定量PCR 技術中，所有患者均在清晨抽取4 至6 毫升空腹靜脈血，每人取3 份標本，且采用EDTA 抗凝劑，將血漿分離后置于零下20℃環境中，微量高速冷凍離心機（廠家：傷害托莫斯科學儀器有效公司），熒光定量PCR 儀器（廠家：美國應用生物系統有限公司），高敏感病毒載量分析儀（廠家：瑞士羅氏公司），檢測試劑盒（廠家：瑞士羅氏診斷產品有限公司）；將分離之后得到的1000μl 血漿，加入專用的離心管中，按照試劑盒的操作要求，設置儀器擴增檢測參數，并上機檢測。試劑均有正式批文，批檢合格并在有效期內使用。

1.3 觀察指標

（1）根據HBV-DNA 值進行分組，可分為6 組，102≤DNA＜103，103≤DNA ＜104，104≤DNA ＜105，105≤DNA ＜106，106≤DNA ＜107，107≤DNA ＜1.7×108（IU/ml），從本研究的結果可以看出，在羅氏PCR 技術檢查下，有9 例小于20IU/ml（羅氏試劑檢測下限），有5 例超過1.7×108IU/ml，剩余106 例在檢測范圍內。而在國產PCR技術檢測中，有35例低于500IU/ml（國產試劑檢測下限），剩余80 例處于國產試劑范圍內。也可以將其按照HBV-DNA 值分為6 組，即102≤DNA ＜103，103≤DNA＜104，104≤DNA ＜105，105≤DNA ＜106，106≤DNA ＜107，DNA ≥107（IU/ml）。

（2）根據乙肝五項定量的檢測結果，對所有的標本進行分組，可以分為HBeAg（+）組和HBeAg（-）組，再對兩種檢測方法的差異性進行分析。

1.4 統計學方法

應用SPSS 20.0 軟件對本研究數據進行統計學分析處理，應用（±s）表示計量資料，應用t檢驗；應用百分率（%）表示計數資料，組間對比應用χ2檢驗。應用P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2.結果

2.1 羅氏內標法熒光定量PCR 技術檢測HBV-DNA 定量結果

經分析，羅氏內標法熒光定量PCR 技術檢測法中，有106例在實際檢測值范圍內，其中在103≤DNA ＜104（33.02%）內的例數最多，其次為104≤DNA ＜105（23.58%），見表1。

表1 羅氏內標法熒光定量PCR 技術檢測HBV-DNA 定量結果（n=106）

2.2 國產普通熒光定量PCR 技術檢測HBV-DNA 定量結果

經分析，國產普通熒光定量PCR 技術檢測法中，有80 例在實際檢測值范圍內，其中在103≤DNA ＜104（30.00%）內的例數最多，其次為104≤DNA ＜105（17.50%），見表2。

表2 國產普通熒光定量PCR 技術檢測HBV-DNA 定量結果（n=80）

2.3 對比兩種方法在HBeAg 陽性患者和陰性患者的檢測結果

經分析，羅氏內標法熒光定量PCR 技術與國產普通熒光定量PCR 技術在HBeAg（+）患者中，檢測結果無顯著差異（P＞0.05）；羅氏內標法熒光定量PCR 技術與國產普通熒光定量PCR 技術在HBeAg（-）患者中，檢測結果具有顯著差異（P＜0.05），見表3。

表3 對比兩種方法在HBeAg 陽性患者和陰性患者的檢測結果[n（%）]

3.討論

乙型肝炎病毒具有較強的傳染性，且作為主要傳染源的急、慢性乙型肝炎病毒攜帶者及其患者，能夠通過血液、體液、母嬰、破損的消化道以及呼吸道進行傳播，尤其是易感人群（即HBsAb陰性者）感染，繼而引發急性或者是慢性的肝臟病變，嚴重威脅著人們的身體健康[5]。我國是一個乙型肝炎病毒個數感染的大國，約有1.2 億感染的人群，因此對于該疾病的準確診斷有著極其重大的意義。血清HBsAg、HBeAb 等檢查被廣泛應用于乙型肝炎患者的診斷中，也可以用于判定疾病的預后情況。但是由于HBV 存在變異株，其基因會將編碼HBeAg 的能力減弱或者是消失，導致在現有的技術中不能進行檢測，故而限制了對乙肝疾病進展的判定[6]。而且，乙型肝炎病毒DNA 載量的檢測在評價乙肝治療指征、治療效果及預后多方面具有重要的意義。

我國現有的PCR 技術是引進國際上公認的羅氏內標法熒光定量PCR 技術，但是該項技術的費用較為昂貴，不能在我國被廣泛使用，因而需要研發一種國產的性價比較高的試劑，且與羅氏檢測技術相類似的檢測方法[7]。但國產的普通熒光定量PCR技術與羅氏內標法熒光定量PCR 技術在結果上的差異尚不明確，因此本研究對乙肝病人進行了兩種檢測方法對比，可以看出，雖然國產的試劑具有一定的局限性，且準確度以及靈敏度一般，但是具有良好的穩定性，能夠大致反映HBV-DNA 水平。本研究中顯示，兩種檢測方法均在103≤DNA ＜104、104≤DNA ＜105中例數最多，表明兩種方法具有較好的一致性。且經研究結果顯示：兩種檢測方法在HBeAg（+）患者中，檢測結果不具有差異性（P＞0.05）；兩種方法在HBeAg（-）患者中，檢測結果具有差異性（P＜0.05），提示在乙肝患者中，HBV-DNA 水平與患者的病情嚴重程度沒有顯著的相關性，當乙肝患者中檢測出HBeAg（-）時，建議應用羅氏內標法檢測，以更準確的判斷患者的疾病情況，以免延誤了患者的診治，使病情進展為肝硬化或肝癌。

綜上所述，兩種檢測方法在檢測HBeAg（+）患者中相比不具有顯著差異，但是在HBeAg（-）患者中差異顯著，因此有明顯乙肝體征、癥狀的患者，若經國產PCR 技術檢測為陰性，建議采用羅氏檢測法進行檢測或者復查，可以使患者得到有效且有價值的診斷與治療。