Mir-125b和PIGF在早期流產孕婦絨毛組織及血清中的表達及意義

楊艷華， 吳 軍， 嚴 格

(湖北省天門市第一人民醫院婦產科， 湖北 天門 431700)

流產分為自然流產和人工流產，其中自然流產發生率占全部妊娠的15%左右，多發生在12周前，病因復雜，包括遺傳、免疫、感染、甚至器官異常、配偶等因素等[1]。然而仍有部分自然流產發生原因不明，子宮胎盤循環異常可能起重要作用，但尚不完全明確。血管內皮生長因子(VEGF)在絨毛膜中表達水平降低與稽留流產有關。胎盤生長因子(placental growth factor，PIGF)是VEGF家族中的一員，能夠促進早孕時滋養層細胞增殖分化及遷移過程，對絨毛膜、腫瘤血管形成發揮重要作用[2]。檢測血清PIGF對胎盤功能評價及子癇前期預測有重要價值。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類內源性調控基因轉錄后表達的非編碼RNA，可通過抑制其下游靶基因參與機體多種疾病發生。胎盤滋養層細胞中微小RNA-125b(mir-125b)可靶向維生素D受體，參與胎盤形成及其生長發育及滋養層細胞凋亡[3]。但關于mir-125b與PIGF在自然流產中的表達及關系尚鮮有報道，因此本研究擬檢測自然流產患者中mir-125b和PIGF表達，以探究其臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料:選擇2017年7月至2019年10月本院收治的孕早期自然流產婦女105例為研究對象，年齡18-35歲，平均年齡(29.13±5.54)歲，平均體質指數(body mass index，BMI)為(22.91±2.46)Kg/m2，孕周4-12周，平均孕周(7.97±1.57)周，有吸煙史者12例，飲酒史者41例。另選擇105例人工流產孕婦為對照組，年齡18-35歲，平均年齡(28.13±5.27)歲，BMI(22.67±2.25)kg/m2，孕周4-12周，平均孕周(7.65±1.54)周，有吸煙史者8例，飲酒史者32例。兩組受試者一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)。本研究經天門市第一人民醫院倫理委員會審批通過，另獲得受試者同意并簽字確認。自然流產女性納入標準：①妊娠12周內自然流產流產孕婦；②彩超提示宮內妊娠，但無胚芽和心管搏動；③白帶檢查、超聲檢查無異常；④男方精液檢查正常，夫妻雙方無染色體異常。對照組納入標準：①妊娠12周內要求人工流產正產妊娠者；②無陰道流血等先兆流產癥狀；③彩超檢查胚胎正常，有胚芽和心管搏動。排除標準：①生殖道畸形或發生感染者；②有既往不良妊娠史或流產史者；③合并高血壓、心臟病、甲狀腺疾病、腎病等疾病患者；④不自愿參加本次調查研究者；⑤就診前3個月使用甾體類激素者；⑥子宮內膜炎或其他可引起流產的慢性傳染病等。

1.2主要試劑及儀器:microRNA定量(qRT-PCR)試劑盒(批號：638315)、TB Green?Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)試劑盒(批號：RR820A)均購自寶生物工程(大連)有限公司；PIGF ELISA試劑盒(批號：EHPGF)、鼠源PIGF抗體(批號：MA1-188)、GAPDH抗體(批號：AM4300)、二抗羊抗鼠IgG(批號：B-2752)均購自美國Invitrogen公司。紫外分光光度計、MODEL550型酶標儀購自美國Thermo公司；7500型RT-qPCR儀購自美國Bio-Rad公司等。

1.3方 法

1.3.1樣本采集:所有女性流產組織取出后，無菌條件下用PBS沖洗，濾紙吸干，將周圍結締組織去除后，分離絨毛膜組織，分裝于2.0mL凍存管，置于液氮中保存待檢。采集所有受試者空腹外周靜脈血，常規分離血清，置于-80℃冰箱待檢。

1.3.2絨毛膜組織中mir-125b、PIGF mRNA水平檢測:絨毛膜組織樣品總RNA采用Trizol提取，并應用紫外分光光度計對總RNA濃度及純度進行檢測。反轉錄得到cDNA，保存于-20℃，備用。mir-125b、PIGF mRNA表達水平采用實時定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)檢測。20μL反應體系：TB Green Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2×) 10 μL，ROX Reference Dye or Dye II(50×)0.4μL ，cDNA(50 ng/μL)2μL，上下游引物(10 μM)各0.8μL，dd H2O 6.0μL。反應條件：95℃，30s；95℃，5s；60℃，34s，共40個循環；添加溶解曲線。mir-125b、PIGF mRNA及內參U6、GAPDH的引物序列見表1。引物由上海吉瑪生物科技有限公司合成。采用2-△△CT法對絨毛膜組織中mir-125b、PIGF mRNA的相對表達水平進行定量分析。

表1 RT-qPCR引物序列

1.3.3絨毛膜組織中PIGF蛋白水平檢測:應用蛋白抽提試劑盒將絨毛膜組織總蛋白提取，蛋白濃度采用BCA試劑盒檢測，并保存于-80℃冰箱，備用。60g蛋白樣品在6%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳2h(電壓80mV)，PVDF膜轉膜70min(恒流250 mA)。然后在室溫條件下，5%脫脂奶粉封閉2 h，并加入適量PBS稀釋(含2%脫脂奶粉)，后加一抗(PIGF抗體1:500；GAPDH抗體1:500)，在4 ℃下孵育過夜，并應用TBST緩沖液洗膜3次，20 min/次，用適量PBS稀釋(含2%脫脂奶粉)的辣根過氧化物酶標記二抗IgG(1:5000)在室溫條件下孵育1.5h，依次洗膜，顯色，曝片，觀察結果并進行分析。

1.3.4血清mir-125b、PIGF水平檢測:血清mir-125b方法采用RT-qPCR，同1.4.2。采用酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測血清PIGF水平，具體操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

2 結 果

2.1自然流產組及對照組女性一般資料比較:對比年齡、BMI、孕周、吸煙史、飲酒史比例，對照組、自然流產組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 自然流產組及對照組女性一般資料比較

2.2自然流產組及對照組女性絨毛膜組織及血清mir-125b、PIGF表達水平比較:與對照組比較，自然流產組女性絨毛膜組織mir-125b水平顯著升高、PIGF mRNA水平顯著降低，血清mir-125b水平顯著升高、PIGF水平顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 自然流產組及對照組女性絨毛膜組織中mir-125b PIGF表達水平比較

2.3自然流產組及對照組女性絨毛膜組織中PIGF蛋白表達水平比較:與對照組比較，自然流產組女性絨毛膜組織中PIGF蛋白水平顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表4、圖1。

表4 自然流產組及對照組女性絨毛膜組織中PIGF蛋白表達水平比較

圖1 WB檢測絨毛膜組織中PIGF蛋白表達

2.4自然流產女性絨毛膜組織、血清mir-125b、PIGF表達水平相關性分析:Pearson法分析結果顯示，自然流產女性絨毛膜組織、血清mir-125b水平與PIGF蛋白水平均呈負相關性(r=-0.643、-0.691，P<0.05)。詳見圖2。

2.5血清mir-125b、PIGF水平對孕早期自然流產患者的預測價值:分別以血清mir-125b、PIGF水平及二者聯合預測值為檢驗變量繪制ROC曲線，結果顯示，血清mir-125b、PIGF水平預測孕早期自然流產發生的曲下面積(area under the curve，AUC)分別為0.896(95%CI：0.850-0.943)、0.884(95%CI：0.838-0.929)，mir-125b≥1.630預測自然流產發生的靈敏度為95.30%，特異度為84.60%，PIGF≤42.553 pg/mL預測自然流產發生的靈敏度為90.60%，特異度為77.90%；二者聯合檢測預測孕早期自然流產發生的AUC為0.954，靈敏度為89.60%，特異度為92.30%。詳見圖3，表5。

圖2 自然流產女性絨毛膜組織、血清中mir-125b、PIGF表達水平相關性分析

圖3 血清mir-125b、PIGF水平對孕早期自然流產發生的預測價值ROC曲線

表5 血清mir-125b PIGF水平對孕早期自然流產發生的預測價值

3 討 論

妊娠是一個極為復雜的過程，妊娠后滋養層細胞血管形成可為胚胎提供氧氣及營養物質，保證胚胎正常發育。如果著床后絨毛血管發育異常或生成不足，則將發生流產。VEGF是一種特殊的內皮細胞有絲分裂原，可促進內皮細胞生長、分化，促進血管生成，在正常人中表達水平低，在胚胎組織、胎盤及妊娠期子宮內膜中呈高表達[4]。PIGF是一種分泌型同源二聚體糖蛋白，屬于VEGF家族，其堿基序列與VEGF同源性高，通過特異性結合血管內皮生長因子受體-1(VEGFR-1)/fms樣酪氨酸激酶受體-1(Flt-1)受體發揮與VEGF相似的生物學功能[5]。研究報道，正常妊娠時，隨妊娠進展血清中PIGF水平呈峰形，健康孕婦血清PIGF妊娠過程中的變化：孕5～15周PLGF水平低，15-26周PIGF表達迅速增加，在妊娠28～30周達高峰，檢測PIGF水平可用于評估胎盤功能及子癇前期發生風險及危險分層[6]。鄭海娜等[7]研究報道，孕早期子癇前期孕婦血清PIGF水平顯著低于正常健康孕婦，且子癇前期血清PIGF水平隨病情嚴重程度增加而降低。本研究結果發現，與對照組比較，自然流產患者絨毛膜組織PIGF mRNA及蛋白、血清PIGF水平均顯著降低，提示PIGF表達降低可能與孕早期自然流產發生有關。miRNA在真核生物中經Dicer酶加工后形成小分子RNA，具有高度保守型、時序性和組織特異性。mir-125家族進化過程中非常保守，由mir-125a、mir-125b-1、mir-125b-2三個成員組成，mir-125家族異常表達與腫瘤發生發展、侵襲轉移及預后密切相關[8]。Nie等[9]研究研究發現，mir-125b在三陰性乳腺癌組織及細胞系中表達水平均顯著高于正常乳腺組織及細胞系，下調mir-125b可通過調控Wnt/β-catenin通路及上皮細胞間質轉化過程抑制乳腺癌細胞增殖、侵襲和遷移。李建華等[10]研究報道，mir-125在肝癌組織及細胞系中表達下調，且在肝癌細胞中，甲基化抑制劑可顯著上調其表達。本研究結果發現，mir-125b在自然流產患者絨毛膜組織、血清表達水平顯著增加，與李建華[10]在肝癌中的結果不符，可能miR-125b在不同疾病中表達模式不同，本研究發還發現mir-125b與PIGF蛋白水平呈負相關，提示mir-125b表達水平上調可能通過抑制PIGF表達，與自然流產發生有關，但具體機制有待進一步探索。本研究還發現，血清mir-125b、PIGF水平預測孕早期自然流產發生的AUC分別為0.896、0.884，mir-125b≥1.630預測自然流產發生的靈敏度為95.30%，特異度為84.60%，PIGF≤42.553pg/mL預測自然流產發生的靈敏度為90.60%，特異度為77.90%；二者聯合檢測AUC高達0.954，特異度高達92.30%，但靈敏度略下降，提示檢測血清mir-125b、PIGF水平對孕早期自然流產發生有一定預測價值，靈敏度有待提高。

綜上所述，早期自然流產孕婦絨毛膜組織中mir-125b水平上調，PIGF水平下調，且二者呈負相關，可能對自然流產發生有一定預測價值。但由于本研究樣本量少，存在不足，另關于mir-125b與PIGF在自然流產患者中是否存在靶向調控關系及具體機制、涉及相關通路及聯合診斷的最佳閾值有待進一步深入探索。