腦膠質(zhì)瘤中UBE2S和CCNB1的表達(dá)及臨床意義

尹璋星， 趙文旭， 廖黎慶， 劉 瑛， 謝 濤， 余 華

(湖北省潛江市中心醫(yī)院神經(jīng)外科， 湖北 潛江 433100)

腦膠質(zhì)瘤是腦部最嚴(yán)重和最常見的原發(fā)性腫瘤，具有侵襲性強(qiáng)，治療難度大、術(shù)后易復(fù)發(fā)、死亡率高的特點(diǎn)[1]。細(xì)胞周期蛋白B1(cyclin B1，CCNB1)能夠調(diào)節(jié)成熟促進(jìn)因子(maturation promoting factor，MPF)，與MPF的催化亞單位細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1(cyclin-dependent kinase 1，CDK1)相互結(jié)合，在細(xì)胞G2/M期交接處驅(qū)動(dòng)細(xì)胞周期時(shí)相轉(zhuǎn)換，啟動(dòng)細(xì)胞有絲分裂[2]。研究表明CCNB1在腫瘤細(xì)胞和組織中高表達(dá)，使細(xì)胞在DNA已受損的情況下MPF仍可被激活，導(dǎo)致細(xì)胞持續(xù)進(jìn)行有絲分裂，最終形成腫瘤[3]。泛素結(jié)合酶E2S(ubiquitin-conjugating enzyme 2S，UBE2S)相對(duì)分子質(zhì)量為24000，屬于泛素-蛋白酶系統(tǒng)中的主要成員，與細(xì)胞周期調(diào)控、凋亡、免疫應(yīng)答、DNA修復(fù)等密切相關(guān)[4]。近幾年，CCNB1和UBE2S在其它腫瘤組織表達(dá)情況逐漸成為研究熱點(diǎn)，而在腦膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)水平研究較少。本研究擬測(cè)定腦膠質(zhì)瘤組織中CCNB1和UBE2S表達(dá)水平，探討二者與腦膠質(zhì)瘤患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，以期為腦膠質(zhì)瘤的預(yù)后提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料:選取2015年1月至2019年4月本院手術(shù)切除的腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本106例，其中男性62例，女性44例，年齡16歲～66歲，平均年齡(41.67±5.64)歲。按照WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的分類標(biāo)準(zhǔn)[5]，進(jìn)行病理組織分級(jí)：Ⅰ～Ⅱ級(jí)68例，歸為低級(jí)別腦膠質(zhì)瘤組；Ⅲ～Ⅳ級(jí)38例，歸為高級(jí)別腦膠質(zhì)瘤組。另選取我院收治的因腦出血或外傷進(jìn)行顱內(nèi)減壓的患者腦組織標(biāo)本114例作為對(duì)照組，其中男性65例，女性49例，年齡15歲～66歲，平均年齡(39.61±4.28)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者經(jīng)病理診斷為腦膠質(zhì)瘤；②患者術(shù)前未接受放療或化療；③所有受試者及家屬對(duì)本研究知情，并簽訂知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患者病例資料不全，無法進(jìn)行隨訪；②患者有心臟病、肝病、高血壓等疾病。本研究經(jīng)潛江市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2主要試劑:蛋白裂解液購自上海貝博生物科技公司，貨號(hào)：BB-3201；BCA蛋白定量試劑盒購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司，貨號(hào)T-17493；兔抗人CCNB1、兔抗人UBE2S、兔抗人β-actin、羊抗兔IgG二抗均購自美國Abcam公司，貨號(hào)：ab1370、ab13702、ab13714、ab0016。

1.3免疫印記(Western blot，WB)法測(cè)定腦膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織中CCNB1、UBE2S表達(dá)水平:首先將所取組織(0.5g)放置于蛋白裂解液中進(jìn)行裂解，收集蛋白質(zhì)使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，通過10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂牛奶中封閉膜1h，加入兔抗人CCNB1(1:1000)、兔抗人UBE2S(1:1000)、兔抗人β-actin(1:1000)一起孵育4℃過夜，然后加入羊抗兔IgG二抗(1:5000)室溫孵育2h，加入蛋白顯色液，采用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)蛋白表達(dá)情況，以β-actin蛋白作為內(nèi)參，來測(cè)定組織中CCNB1和UBE2S蛋白含量。

1.4隨訪:所有腦膠質(zhì)瘤患者術(shù)后均接受常規(guī)隨訪，隨訪時(shí)間6～48個(gè)月，本次隨訪截止日期2019年10月，死亡患者以死亡日期作為隨訪截止時(shí)間，本次隨訪的中位時(shí)間25.89個(gè)月。觀察并記錄腦膠質(zhì)瘤患者在隨訪期間復(fù)發(fā)和生存情況。

2 結(jié) 果

2.1三組間CCNB1和UBE2S表達(dá)水平比較:對(duì)照組、低級(jí)別腦膠質(zhì)瘤組和高級(jí)別腦膠質(zhì)瘤組之間CCNB1和UBE2S表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中高級(jí)別腦膠質(zhì)瘤組CCNB1和UBE2S表達(dá)水平明顯高于低級(jí)別腦膠質(zhì)瘤組和對(duì)照組(P<0.05)，低級(jí)別腦膠質(zhì)瘤組CCNB1和UBE2S表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，見表1。

表1 UBE2S和CCNB1在各類腦膠質(zhì)組織上表達(dá)水平

2.2CCNB1、UBE2S表達(dá)水平與腦膠質(zhì)瘤患者臨床病理指標(biāo)的關(guān)系:將腦膠質(zhì)瘤患者進(jìn)行分組，CCNB1和UBE2S表達(dá)水平高于各組平均數(shù)的患者記為高表達(dá)，等于或者低于表達(dá)水平均數(shù)的患者記為低表達(dá)。CCNB1和UBE2S在腦膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)水平與患者的年齡、性別、病理學(xué)類型無關(guān)(P>0.05)，與腫瘤的組織分化程度、瘤周水腫、浸潤程度有關(guān)(P<0.05)，見表2。

表2 CCNB1 UBE2S表達(dá)水平與腦膠質(zhì)瘤患者臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

2.3腦膠質(zhì)瘤組織中CCNB1和UBE2S表達(dá)水平的相關(guān)性:Pearson法分析結(jié)果表明，腦膠質(zhì)瘤組織中CCNB1和UBE2S表達(dá)水平呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=0.460，P<0.05)，見圖1。

2.4CCNB1和UBE2S表達(dá)水平與腦膠質(zhì)瘤患者術(shù)后生存時(shí)間的關(guān)系:CCNB1高表達(dá)腦膠質(zhì)瘤患者術(shù)后中位生存時(shí)間為32.03個(gè)月，顯著短于CCNB1低表達(dá)患者術(shù)后中位生存時(shí)間44.15個(gè)月(P<0.05)，見圖2。UBE2S高表達(dá)腦膠質(zhì)瘤患者術(shù)后中位生存時(shí)間為31.50個(gè)月，顯著短于UBE2S低表達(dá)患者46.68個(gè)月(P<0.05)，見圖3。

2.5影響腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素:單因素分析表明，組織低分化、瘤周高度水腫、有浸潤、CCNB1高表達(dá)、UBE2S高表達(dá)均是影響腦膠質(zhì)瘤患者不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素(P<0.05)。多因素分析表明，組織低分化、CCNB1高表達(dá)、UBE2S高表達(dá)是影響腦膠質(zhì)瘤患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見表3。

表3 Cox回歸分析腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素

圖1 腦膠質(zhì)瘤組織中CCNB1和UBE2S表達(dá)水平的相關(guān)性

圖2 CCNB1表達(dá)水平與腦膠質(zhì)瘤患者術(shù)后生存時(shí)間關(guān)系

圖3 UBE2S表達(dá)水平與腦膠質(zhì)瘤患者術(shù)后生存時(shí)間關(guān)系

3 討 論

過去認(rèn)為腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病原因與顱腦外傷、內(nèi)分泌失調(diào)、病毒感染、生化因素等密切相關(guān)，隨著對(duì)腦膠質(zhì)瘤更深入研究，發(fā)現(xiàn)癌癥發(fā)生發(fā)展與分子水平改變有關(guān)，在致癌因素刺激下，致癌基因異常表達(dá)或抑癌基因表達(dá)沉默，使得細(xì)胞調(diào)控機(jī)制紊亂，細(xì)胞增殖失控，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展[6,7]。

近年為直觀了解腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，探究腫瘤細(xì)胞周期調(diào)控因子成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)，CCNB1和UBE2S在腫瘤細(xì)胞增殖、調(diào)控中發(fā)揮著重要作用[8]。Fei等[9]研究表明CCNB1在皮膚惡性腫瘤患者外周血中高表達(dá)，且腫瘤惡性程度越高，CCNB1表達(dá)水平也越高，因此CCNB1可作為反應(yīng)皮膚惡性腫瘤惡性程度參考指標(biāo)。王玲等[10]研究表明CCNB1在乳房外Paget病中高表達(dá)，可能參與細(xì)胞周期調(diào)控，致使細(xì)胞異常增殖，最終發(fā)展成腫瘤。Ding等[11]研究表明CCNB1在胃癌組織中高表達(dá)，并與慢性胃病、胃癌前病變、胃癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，提示其在胃癌的演變過程中發(fā)揮著重要作用。胡力等[12]研究表明UBE2S在惡性膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，敲低UBE2S后，可以降低非同源末端連接復(fù)合物DNA修復(fù)效率，從而加強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)放、化療的敏感性。曹進(jìn)等[13]發(fā)現(xiàn)UBE2S在膽囊癌組織中表達(dá)水平顯著高于膽囊癌前病變和良性病變組織，UBE2S高表達(dá)膽囊癌患者生存期較短，是膽囊癌患者不良預(yù)后的獨(dú)立因素。

本研究采用免疫印記法測(cè)定腦膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織中CCNB1、UBE2S表達(dá)水平，結(jié)果表明低級(jí)別腦膠質(zhì)瘤組和高級(jí)別腦膠質(zhì)瘤組CCNB1和UBE2S表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，且高級(jí)別腦膠質(zhì)瘤組顯著高于低級(jí)別腦膠質(zhì)瘤組，提示CCNB1和UBE2S表達(dá)水平與腦膠質(zhì)瘤有密切關(guān)系，隨病情嚴(yán)重程度升高。另外，本研究發(fā)現(xiàn)腦膠質(zhì)瘤患者CCNB1和UBE2S表達(dá)水平與年齡、性別、病理學(xué)類型無關(guān)，與腫瘤組織分化程度、瘤周水腫、浸潤程度有關(guān)，提示CCNB1和UBE2S可能參與腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過程。Pearson分析表明CCNB1和UBE2S表達(dá)水平呈正相關(guān)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，CCNB1、UBE2S高表達(dá)腦膠質(zhì)瘤患者術(shù)后中位生存時(shí)間分別顯著短于低表達(dá)患者，提示CCNB1、UBE2S高表達(dá)水平者預(yù)后更差。采用COX多因素分析發(fā)現(xiàn)，組織低分化、CCNB1高表達(dá)、UBE2S高表達(dá)是影響腦膠質(zhì)瘤患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示CCNB1和UBE2S可能作為判斷腦膠質(zhì)瘤預(yù)后的臨床指標(biāo)，對(duì)此臨床及時(shí)檢測(cè)CCNB1和UBE2S水平可及時(shí)預(yù)測(cè)預(yù)后，也為臨床治療提供一定參考。