環磷酰胺對百草枯中毒家兔肺過氧化損傷的干預作用

蔣昌華, 簡萬均, 符宜龍, 唐中建, 舒艾婭

(重慶市涪陵中心醫院重癥醫學科, 重慶 408000)

百草枯是一種聯砒啶類高效除草劑，因其能在土壤中迅速鈍化，對環境污染較小，且除草效果好，在全球范圍內被廣泛使用[1]。百草枯的毒性極高，無特效解毒藥，可經消化道、呼吸道以及皮膚黏膜吸收，中毒后死亡率可高達60%～70%[2]。百草枯進入機體后可隨血液分布至各組織器官，引起全身多臟器功能損害。肺是百草枯的主要靶器官，肺泡上皮細胞存在百草枯特殊性轉運體，導致百草枯在肺組織內大量聚集，繼而引起肺泡充血、水腫，最終引發不可逆的肺纖維化[3]。臨床上對于百草枯中毒尚無特異性解毒劑，主要采取對癥治療和給予激素、免疫抑制劑等藥物為主，但治療效果并不理想，病死率依然居高不下[4]。環磷酰胺屬于免疫調節類制品，能夠增強機體免疫力，緩解肺部炎癥反應程度[5]。有研究[6]表明，環磷酰胺聯合糖皮質激素沖擊治療能夠有效降低降低百草枯中毒患者的死亡率，但其作用機制尚不清楚。本文通過檢測百草枯中毒家兔血清轉化生長因子-β1(TGF-β1)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)表達情況，探討環磷酰胺干預對血清細胞因子的影響，為環磷酰胺治療百草枯中毒的作用機制的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1實驗動物:選取清潔級健康家兔40只，雌雄不限，月齡3～6個月，體重2.5～3.0kg。實驗動物購于重慶醫科大學動物實驗中心，動物合格證號：SYXK(渝)2012-0001；家兔購入后單籠飼養，保持飼養環境清潔開放，飲水自由、定時給予飼料，觀察動物情況，1周后將飲食、排泄以及精神狀況正常家兔納入研究備用。

1.2實驗試劑與藥品:20%百草枯溶液購于北京先正達公司，生理鹽水(H20054037)購于安徽雙鶴藥業，環磷酰胺(H14023686，0.2g/支)購于山西普德藥業，甲強龍(H20123319，0.5g/支)購于天津金耀藥業，TGF-β1檢測試劑盒購于深圳丹納赫公司，MDA、SOD檢測試劑盒購于南京建成生物研究所，XS2型酶標儀購自鉑金埃爾默儀器公司。

1.3動物造模及干預:將40只家兔隨機分為對照組、模型組、甲強龍組、環磷酰胺+甲強龍組，每組10只。模型組、甲強龍組、環磷酰胺+甲強龍組根據動物體質量按照50mg/kg劑量進行百草枯溶液灌胃染毒，對照組則給予相同劑量生理鹽水灌胃。動物染毒后24h開始干預治療，其中對照組和模型組動物按照3mL/kg劑量腹腔注射生理鹽水，甲強龍組按照0.4mg/kg劑量腹腔注射甲強龍，環磷酰胺+甲強龍組同時給予0.4mg/kg甲強龍和60mg/kg環磷酰胺；每日上午給藥，連續7d。

1.4標本采集與檢測:分別在干預治療1d、3d、5d、7d后經耳緣靜脈采集血液標本3mL，靜置10min，3000r/min離心15min，吸取血清-80℃保存待檢。按照試劑盒說明書采用酶聯免疫法檢測血清TGF-β1水平，硫代巴比妥酸法測定血MDA水平，黃嘌呤氧化酶法測定SOD活力。

2 結 果

2.1實驗動物情況:對照組動物在研究過程中活動自如，食水攝入正常，體質量趨于穩定。模型組動物染毒后1～3h后即逐步顯現出中毒癥狀，初表現為反應遲鈍、精神萎靡、食水攝入量減少；染毒1d后食欲持續降低、口鼻可見淡紅色分泌物；染毒后3d后出現呼吸急促、流涎、腹瀉等癥狀。甲強龍組和環磷酰胺+甲強龍組治療過程中毒表現與模型組大致相同，如呼吸急促、食水攝入量減少、精神萎靡等，但甲強龍組和環磷酰胺+甲強龍組癥狀較輕、持續時間較短，治療后第5d后癥狀開始緩解，精神狀況有所改善，食欲逐漸恢復，呼吸也逐漸平穩。

2.2各組兔不同時點血清TGF-β1水平比較:染毒后1d，模型組、甲強龍組、環磷酰胺+甲強龍組血清TGF-β1水平均高于對照組(P<0.05)，而模型組、甲強龍組和環磷酰胺+甲強龍組血清TGF-β1水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。染毒后3d、5d、7d時，模型組血清中TGF-β1水平均顯著高于對照組(P<0.05)；甲強龍組和環磷酰胺+甲強龍組血清中TGF-β1水平明顯低于模型組(P<0.05)，但均顯著高于對照組(P<0.05)；環磷酰胺+甲強龍組血清中TGF-β1水平均低于甲強龍組(P<0.05)，見表1。

表1 各組動物染毒后不同時點血清TGF-β1水平比較

2.3各組兔在不同時點血清MDA水平比較:染毒后1d，模型組、甲強龍組、環磷酰胺+甲強龍組血清MDA水平均高于對照組(P<0.05)，而模型組、甲強龍組和環磷酰胺+甲強龍組血清MDA水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。染毒后3d、5d、7d時，模型組血清MDA水平均顯著高于對照組(P<0.05)；甲強龍組和環磷酰胺+甲強龍組血清MDA水平均低于模型組(P<0.05)，但又明顯高于對照組(P<0.05)；環磷酰胺+甲強龍組血清MDA水平均顯著低于甲強龍組(P<0.05),見表2。

2.4各組兔在不同時點血清MDA、SOD水平比較:染毒后1d，模型組、甲強龍組、環磷酰胺+甲強龍組血清SOD水平均低于對照組(P<0.05)，而模型組、甲強龍組和環磷酰胺+甲強龍組血清SOD水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。染毒后3d、5d、7d時，模型組血清SOD水平均明顯低于對照組(P<0.05)；甲強龍組和環磷酰胺+甲強龍組血清SOD水平高于模型組，但顯著低于對照組(P<0.05)；環磷酰胺+甲強龍組血清SOD水平均明顯高于甲強龍組(P<0.05)，見表3。

表2 各組動物染毒后不同時點血清MDA水平比較

表3 各組動物染毒后不同時點血清SOD水平比較

3 討 論

百草枯是一種觸殺型砒啶類除草劑，能夠阻斷植物細胞電子轉運系統，導致細胞內氧自由基大量聚集，從而對接觸的綠色植物起殺滅作用[7]。有研究[8]發現，百草枯與內源性聚胺類分子的結構類似，肺泡上皮細胞存在聚胺類物質的轉運體，百草枯會在肺部逆濃度差吸收，肺組織中百草枯的蓄積濃度可達到血漿的80～90倍。一項關于百草枯中毒患者隨訪研究[9]發現，百草枯中毒初期即使存在輕度肺損傷，也會造成肺部嚴重的彌散性功能障礙，甚至出現不可逆的肺纖維化。

TGF-β1是判斷組織纖維化程度的重要指標，主要由肺泡巨噬細胞和肺間質細胞釋放，其過表達會導致成纖維細胞大量聚集，促進膠原蛋白的沉積，加快組織纖維化進程[10]。MDA是膜脂過氧化反應產物，能間接反映膜系統過氧化程度；SOD是生命體中重要活性物質，能消除新陳代謝過程中產生的氧自由基，從而發揮抗氧化作用[11]。本研究顯示，模型組動物染毒后各時點血清TGF-β1和MDA水平均顯著升高，且SOD水平則明顯降低；且隨著時間的推移，血清TGF-β1和MDA呈升高趨勢，血清SOD水平則呈明顯降低趨勢。提示氧化應激參與百草枯中毒的肺損傷過程，隨著中毒時間的推移，體內超氧自由基集聚，導致肺過氧化損傷逐漸加重。

甲強龍是一種人工合成的糖皮質激素，具有較強抗炎和免疫抑制作用，能夠提高機體對有害刺激的應激能力，從而抑制纖維細胞活性，減輕肺纖維化進程[12]。環磷酰胺是一種免疫調節藥物，能夠緩解炎癥反應，減少白細胞的表達，減輕肺部炎癥損傷。本研究結果顯示，甲強龍組和環磷酰胺+甲強龍組家兔在染毒后治療的第1d血清TGF-β1、MDA、SOD水平與模型組無明顯差異，可能是由于療程較短，尚不能有效扭轉百草枯所造成的毒性損傷。隨著時間的推移，甲強龍組和環磷酰胺+甲強龍組家兔血清TGF-β1、MDA水平逐步降低，血清SOD水平逐漸升高，說明在連續使用環磷酰胺和甲強龍治療后，體內氧化-抗氧化平衡逐漸恢復，肺組織損傷也得到改善。環磷酰胺+甲強龍組家兔在治療第3d、5d、7d血清TGF-β1、MDA及SOD水平改善程度優于甲強龍組，提示在甲強龍治療基礎上加用環磷酰胺能降低百草枯中毒導致的氧化反應程度，減輕肺過氧化損傷，扭轉肺纖維化病情。

綜上所述，環磷酰胺能有效降低TGF-β1、MDA的表達和提高血清SOD濃度，促進機體氧化-抗氧化平衡，改善百草枯中毒引起的肺過氧化損傷。