miRNA-21 miRNA-155和miRNA-195診斷乳腺癌間接比較的Meta分析

張敏杰， 郭團茂， 楊飛飛

(陜西省咸陽市中心醫院， 陜西 咸陽 712000)

乳腺癌(breast cancer, BC)是發生在乳腺上皮組織的惡性腫瘤，隨著疾病的進展，脫落的癌細胞一旦進入循環系統就會隨血液或淋巴液散播全身，進而轉移到身體各個重要臟器，威脅生命。目前用于乳腺癌診斷的手段主要有乳腺超聲、乳腺鉬靶X線攝影、乳腺磁共振成像、組織病理學檢查、血清學標志物檢測等。近年來，隨著實時熒光定量PCR技術在miRNAs檢測中的應用逐漸成熟，使得miRNAs極有可能成為BC診斷的新一代血清學標志物。已有大量的研究表明外周血循環miRNAs在乳腺癌篩查、診斷方面具有重要的價值。2005年，Iorio等[1]首次報道了人乳腺癌中miRNAs表達譜的改變，鑒定出了29種miRNAs存在表達失調現象。其中miRNA-10b、miRNA-125b 和miRNA-145表達明顯下調，而miRNA-21及miRNA-155的表達則顯著上調。Hannafon等[2]通過分離提取16名無乳腺癌病史的健康婦女和16名乳腺癌患者的血漿樣本中外泌體總RNA，采用實時定量PCR技術分析幾種特異性分泌的miRNAs，發現BC患者血漿外泌體中的miRNA-1246，miRNA-21表達與對照組相比明顯上調。多個miRNAs的表達與乳腺癌的臨床病理特征相關，miRNAs普遍存在于人體內，而與BC相關聯的循環miRNAs種類較多，且表達量各有差異。我們大量檢索國內外檢測miRNAs對BC進行診斷準確性研究的診斷性試驗，通過收集、匯總眾多的研究之間已發表的相關實驗數據，并進行系統性的分析，最終我們選取miRNA-21、miRNA-155和miRNA-195以評價這三種miRNAs在乳腺癌診斷方面的價值。目前雖已有許多臨床研究以術后組織病理檢查作為金標準評價這三種miRNAs檢測對BC的診斷價值，然而尚無各miRNAs之間相互比較的研究。在直接比較研究證據不足的情況下，本研究通過間接比較的方法借助已開展的組織病理檢查來實現miRNA-21、miRNA-155和miRNA-195對BC診斷價值的間接比較，以期為后續研究提供數據支持。

1 資料與方法

1.1資料來源及文獻檢索策略:檢索策略：以目標疾病、待評價診斷試驗、診斷準確性指標擬定檢索詞并結合自由詞最終確定中文檢索詞為：“乳腺癌”、“乳腺腫瘤”、“乳腺惡性腫瘤”、“外周血循環微小RNA”、“微小RNA”、“miRNA”、“miRNAs”、“診斷”、“敏感性”、“特異性”、“敏感度”、“特異度”。英文檢索詞為“breast neoplasm”、“breast tumor”、“breast cancer”、“miRNA”、“miRNAs”、“diagnoses”、“sensitivity”、“specificity”。資料來源：PubMed、EMbase、Medline、The Cochrane Library、中國生物醫學文獻檢索數據庫(Chinese Biological Medicine Database, CBM))、中國期刊全文數據庫(China National Knowledge Infrastructure, CNKI)、萬方科技期刊全文數據庫、維普中文科技期刊全文數據庫，檢索時限從建庫到2019年10月，語種為中、英文。同時手工檢索其他相關文獻并對納入文獻的參考文獻進行追蹤以補充獲取更多文獻，具體篩選過程見圖1。

1.2文獻納入與排除標準:文獻納入標準：①研究類型：以組織病理檢查為金標準，對BC進行診斷準確性研究的診斷性試驗。②研究對象：經過組織病理檢查組織類型明確為BC患者，且對照類型明確，不限制年齡、病因、種族。③診斷試驗的方法:外周血(全血/血清/血漿)循環miRNAs表達對BC診斷價值的研究。④結局指標：合并敏感性、合并特異性、合并陽性似然比、合并陰性似然比、合并診斷優勢比、繪制受試者工作特征(summary receiver operating characteristic，SROC)曲線并計算曲線下面積(area under curve，AUC)；miRNA-21、miRNA-155和miRNA-195三個診斷試驗間接比較的相對診斷比值比(relative diagnostic odds ratio, RDOR)結果。排除標準：①病例組為合并其他組織器官惡性腫瘤的患者，或者病例為復發、轉移乳腺癌的研究。②無法獲取BC四格表數據的研究。③數據資料有誤或者數據不完整的研究；④同一作者或者研究單位對同一人群進行的重復研究或重復發表的研究。

圖1 文獻篩選流程及結果

圖2 納入研究的質量評價

1.3文獻篩選、資料提取和質量評價:由2位作者通過逐篇閱讀文獻進行獨立篩選并提取資料，雙方同時納入的文獻采用QUADAS-2(Quality Assessment of Diagnostic Accuracy Studies-2)工具進行偏倚風險評價，存在分歧的文獻最后共同協商處理。提取資料主要包括第一作者；發表年份；研究對象所在國家；病例的病理類型；對照類型；病例組與對照組樣本總數；miRNAs檢測方法；Cut-off值；樣本類型；miRNAs的類型；四格表數據真陽性(true positivity，TP)、假陽性(false positivity，FP)、假陰性(false negativity，FN)、真陰性(true negativity，TN)。采用QUADAS-2工具進行偏倚風險評價，由2位作者獨立使用修改后的QUADAS-2工具對所有研究進行評價，結果所得一致性較好。

1.4統計學方法:采用Meta-Disc1.4軟件進行Meta分析，分別對miRNA-21、miRNA-155和miRNA-195這3種診斷試驗各研究間的閾值效應進行分析，通過計算敏感性的對數與(1-特異性)對數的Spearman相關系數檢驗，P<0.05提示存在閾值效應。運用Meta-Disc1.4軟件分別對miRNA-21、miRNA-155和miRNA-195各診斷試驗內部各研究間異質性進行分析，通過計算診斷優勢比(diagnostic odds ratio，DOR)的Cochran-Q值，I2值檢驗異質性。P>0.05，I2<50%則無統計學異質性，采用固定效應模型合并效應量。當P<0.05，I2>50%為存在統計學異質性，采用隨機效應模型合并效應量包括：合并敏感性、合并特異性、合并陽性似然比、合并陰性似然比、合并DOR。采用RevMan5.3實現在同一個圖形中呈現3個診斷試驗的SROC曲線，以Meta-Disc1.4軟件計算AUC。運用R軟件的“netmeta”安裝包實現miRNA-21、miRNA-155和miRNA-195進行間接比較的RDOR結果。本研究是基于組織病理診斷的金標準比較各個miRNAs的間接比較，屬于網狀Meta類型中星形網狀Meta分析，符合相似性條件，且不存在直接比較的數據不需要進行一致性檢驗。當RDOR結果的置信區間包含1時，提示2種診斷試驗之間的差異無統計學意義。若A vs B，當RDOR>1且置信區間不包含1，則A的診斷價值較B大；當RDOR<1且置信區間不包含1，則A的診斷價值較B小，提示2種診斷試驗之間的差異具有統計學意義。采用亞組分析異質性來源，采用Stata 12.0軟件繪制Deek's漏斗圖非對稱檢驗評估是否存在發表偏倚，P<0.05為差異有統計學意義，表明存在發表偏倚。

2 結 果

2.1文獻檢索結果及納入研究的基本情況:初檢獲得文獻780篇，最終納入文獻17篇，具體篩選流程見圖1。有關miRNA-21對BC診斷的原始文獻9篇，中文3篇，英文6篇。BC組共計納入患者為565例，對照組納入受試者為432例；有關miRNA-155對BC診斷的原始文獻6篇，中文1篇，英文5篇。BC組納入患者為596例，對照組納入受試者為236例。有關miRNA-195對BC診斷的原始文獻5篇，中文3篇，英文2篇。BC組納入患者為415例，對照組納入受試者為319例。共計BC患者1576例，對照987例。17篇文獻中Mar-Aguilar F[6]和Han J G[11]兩篇文獻同時對miRNA-21和miRNA-155進行檢測。張文昭[10]等的研究同時對miRNA-21和miRNA-195進行檢測。納入研究的基本信息見表1。

2.2納入文獻質量評價和偏倚風險評價:本研究納入文獻的對照類型有BC高風險者、良性乳腺疾病患者和健康人。病例選擇過程中3篇文獻連續納入病例[7,16,18,]；4篇文獻中將非BC的患者納入病例[4,5,8,10]；所有文獻均為病例-對照研究；所有原始文獻中納入病例均經過組織病理檢查確診，因此17篇文獻病例選擇適用性評價均為“低不適用性考慮”。在進行待評價診斷試驗評價中發現所有文獻均未采用盲法對病例和對照miRNAs進行檢測；有4篇[8,10,13,16,]文獻無Cut-off值在適用性考慮中評價為“高不適用性考慮”，同時偏倚風險評價結果為“高風險”。對金標準部分進行偏倚風險評價，17篇文獻均評價為“低風險”；有7篇文獻明確說明BC病例的組織病理類型，適用性考慮評價結果為“低不適用性考慮”。所有原始研究均無失訪者或遺漏病例。偏倚風險評價及適用性判斷結果見圖2。

2.3Meta分析結果

2.3.1miRNA-21、miRNA-155和miRNA-195對BC的診斷價值評估:納入有關miRNA-21、miRNA-155和miRNA-195對BC診斷文獻的Spearman相關系數分別為0.315(P=0.409)；-0.086(P=0.872)；0.300(P=0.624)提示定量評價無閾值效應。各診斷試驗與金標準比較合并分析結果如下，采用固定效應模型對miRNA-21診斷BC的研究進行Meta分析，結果合并敏感性為0.73(95% CI 0.69～0.77)、合并特異性為0.86(95% CI 0.83～0.89)、合并陽性似然比為4.99(95% CI 3.86～6.46)、合并陰性似然比為0.34(95% CI 0.29～0.39)、合并診斷優勢比(DOR)為15.18(95% CI 10.79～21.37)、SROC曲線下面積(AUC)為：0.885；采用隨機效應模型對miRNA-155診斷BC的Meta分析結果:合并敏感性為0.81(95% CI 0.78～0.84)、合并特異性為0.85(95% CI 0.80～0.89)、合并陽性似然比為4.90(95% CI 2.33～10.31)、合并陰性似然比為0.16(95% CI 0.07～0.33)、合并DOR為44.22(95% CI 11.74～166.53)、AUC為：0.933。采用固定效應模型對miRNA-195診斷BC的Meta分析結果:合并敏感性為0.76(95% CI 0.72～0.80)、合并特異性為0.89(95% CI 0.85～0.93)、合并陽性似然比為6.59(95% CI 4.77～9.12)、合并陰性似然比為0.27(95% CI 0.23～0.33)、合并DOR為28.41(95% CI 17.98～44.89)、AUC為：0.910。miRNA-155診斷BC的SROC曲線下面積大于miRNA-21和miRNA-195的曲線下面積，提示miRNA-155的診斷準確性略優于miRNA-21和miRNA-195，見圖3。

表1 納入研究的基本資料

圖3 miRNA-21、miRNA-195和miRNA-195診斷BC的SROC曲線

2.3.2miRNA-21、miRNA-155和miRNA-195診斷BC進行間接比較的RDOR結果:以組織病理檢查(histologically, HIS)作為共同的診斷標準，間接比較結果顯示miRNA-155 vs miRNA-21的RDOR值為0.56(95% CI 0.19～1.70)；miRNA-195 vs miRNA-21的RDOR值為0.56(95% CI 0.18～1.74)；miRNA-195 vs miRNA-155的RDOR值為1.00(95% CI 0.28～3.63)。結果提示miRNA-21、miRNA-155和miRNA-195對BC的診斷準確性之間差異無統計學意義。見圖4。

2.3.3異質性檢驗:非閾值效應引起的異質性檢驗結果顯示，納入miRNA-21診斷BC的9項研究DOR對應的Cochran-Q=13.85 (P=0.085 8)，I2=42.2%。納入的各研究間無統計學異質性。納入miRNA-195診斷BC的5項研究DOR對應的Cochran-Q=6.20 (P=0.184 9)，I2=35.5%。各研究間無統計學異質性。納入miRNA-155診斷BC的6項研究DOR對應的Cochran-Q=27.16 (P=0.000 1)，I2=81.6%。按照以下因素進行亞組分析，尋找異質性來源：地區(分為“中國組”和“國外組”)；Cut-off值(分為“有Cut-off值組”和“無Cut-off值組”)；病理類型(分為“有分型組”和“無分型組”)。亞組分析結果未發現任何亞組之間存在顯著差異。

圖4 miRNA-21、miRNA-155和miRNA-195對BC診斷RDOR值調整間接比較森林圖

2.3.4敏感性分析和發表偏倚:分別將納入miRNA-21、miRNA-155和miRNA-195診斷BC的文獻中結果差異較大的文獻或者樣本量較大的文獻剔除后再次進行Meta分析，3種診斷試驗結果均無明顯變化，說明3種診斷試驗研究穩定性好，結果可信。分別對納入3種診斷試驗中的研究采用線性回歸的方法檢驗是否存在發表偏倚，繪制Deek's漏斗圖，結果納入miRNA-21的9篇文獻斜率系數的t=0.29(P=0.777)，無明顯發表偏倚；納入miRNA-155的6篇文獻斜率系數的t=1.40(P=0.235)，無明顯發表偏倚；納入miRNA-195的5篇文獻斜率系數的t=0.30(P=0.781)，無明顯發表偏倚。

3 討 論

MiRNAs是一類長度約為18～24個核苷酸的非編碼小分子RNA，廣泛分布于細菌、真菌、病毒顆粒、真核生物等生命體內。據統計，在人體內探明的miRNAs數量僅相當于編碼基因的1%左右，但它卻調控著人類約三分之一的基因。MiRNAs主要在轉錄后水平參與對靶基因的調控，每個miRNAs可對多個靶基因進行調控，而多個miRNAs也可協同起來調節同一個靶基因，因此其調節過程極為復雜。研究表明癌癥誘發因素與原癌基因、抑癌基因之間的相互作用在癌癥的發生、發展中起到關鍵作用[20,21]。乳腺癌的發生發展也是一個多基因改變的過程，受miRNAs的調控作用。研究發現miRNA-21通過作用于抑癌基因PTEN[22]及腫瘤抑制基因原肌球蛋白1(tropo myosin 1，TPM1)[23]而促進腫瘤的發生發展。另有報道它也能直接作用于程序性細胞死亡因子4(programmed cell death 4，PDCD4)與乳腺絲氨酸蛋白酶抑制劑(maspin)而介導腫瘤的轉移與侵襲[24]。然而miRNA-21在乳腺癌中的表達水平并不是一成不變的，整體上在血清樣本中是上調的，按臨床分期進行分析結果表明，在I期和IV期患者樣本中上調幅度較大，而在Ⅱ期和Ⅲ期樣本中上調的趨勢則不明顯[3]。除miRNA-21外，另有Heneghan H M[16]等的研究報道顯示，與前列腺癌、腎癌、結腸癌等比較，外周血miRNA-195在乳腺癌患者中具有相對特異性表達，對其進行檢測可以從其他種類的惡性腫瘤患者以及健康人中鑒別出乳腺癌患者。近期有研究表明，miRNA-155的過度表達與腫瘤的轉移侵襲密切相關，其機制主要包括促進腫瘤細胞上皮-間質轉化、抑制細胞凋亡等[25,26]。近年來，循環miRNAs作為腫瘤診斷和預后評價的分子標志不僅具有創傷小，方法準確、便捷的優勢，并且其表達模式會隨著癌癥的進展而相應變化，因此被視為新一代的循環腫瘤標志，而BC患者血清miRNAs水平與臨床病理的關系及其對診斷與預后預測的作用已成為目前的研究熱點。本文通過對納入的17項研究進行系統Meta分析，綜合評價以組織病理檢查作為參考標準對BC進行診斷準確性研究的診斷試驗。通過計算合并診斷效應量、擬合SROC曲線、計算間接比較的RDOR結果并繪制調整間接比較森林圖以評價miRNA-21、miRNA-155和miRNA-195對BC的診斷效能，通過亞組分析探索納入miRNA-155診斷BC的各診斷試驗間的異質性來源，最后通過敏感性分析和檢測發表偏倚評估本研究的可信度。結果顯示：miRNA-155診斷BC的敏感性為81%，特異性為85%，合并DOR為44.22，AUC為0.933。表明miRNA-155對BC診斷價值優于miRNA-21和miRNA-195。但納入的6項研究間存在高度異質性(81.6%)。經Spearman相關系數檢驗，異質性與閾值效應無關。進一步進行亞組分析，未發現任何亞組之間存在顯著差異。我們采用RevMan5.3實現在同一個圖形中呈現3種診斷性試驗的SROC曲線圖，結果顯示miRNA-155診斷BC的SROC曲線下面積大于miRNA-21和miRNA-195的曲線下面積，提示miRNA-155的診斷準確性優于miRNA-21和miRNA-195，但是該圖僅能進行直觀的描述性分析，未能進行定量比較。因此，我們以組織病理檢查作為共同的診斷標準，通過計算miRNA-21、miRNA-155和miRNA-195兩兩之間的RDOR值實現三者之間的間接比較。RDOR值調整間接比較森林圖顯示miRNA-155對BC的診斷準確性與miRNA-21和miRNA-195的診斷準確性之間的差異無統計學意義。為評價納入各個診斷試驗中研究的穩定性，本文每次剔除1篇文獻后，計算各個診斷試驗合并DOR值，結果均未發生明顯變化，提示本研究受單個文獻的影響較小，同時Deek's漏斗圖結果顯示3種miRNAs診斷試驗均無明顯發表偏倚說明本研究分析結果穩定可靠。由于診斷試驗準確性網狀Meta分析統計學方法尚未完善，我們未能提供納入各研究之間的相似性結果、總體異質性的結果。因此更合理可靠的結論還需要依靠診斷試驗準確性網狀Meta分析統計學方法的發展與成熟以及相關軟件的研發。

通過采用Meta分析和基于組織病理檢查作為共同參考標準的間接比較方法評價miRNA-21、miRNA-155和miRNA-195在BC診斷中的臨床價值。結果顯示三種miRNAs均具有較高的臨床診斷價值，有望成為BC診斷的新一代血清學標志物。