肝細胞癌組織中TRIM59、Akt及N-cadherin表達及其臨床意義

薛棟 舒孟良 張建 夏修良 陳雨信

(濱州市人民醫院 1普外一科，山東 濱州 256610；2重癥醫學科；3病理科；4山東大學齊魯醫院肝膽外科)

肝細胞癌(HCC)是消化系統較常見的腫瘤，我國是慢性乙型病毒性肝炎大國，慢性乙型病毒性肝炎-肝硬化-HCC是肝病患者的自然過程，HCC導致了嚴重的社會和經濟負擔。目前，手術切除仍是早期HCC的最佳治療方案，中、晚期HCC主要采用以放化療、靶向、免疫聯合中藥為主的綜合治療。盡管針對HCC的藥物更新換代，但5年生存率并沒有明顯提高，肝內復發和遠處臟器轉移是主要致死原因〔1〕。三結構域蛋白(TRIM)家族在腫瘤發生發展、侵襲轉移中起重要作用〔2〕。TRIM59在許多惡性腫瘤中有高表達如結直腸癌、肺癌和骨肉瘤等，且與腫瘤侵襲轉移和遠期生存率密切相關〔3～5〕。磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)是細胞增殖、凋亡及侵襲轉移等過程中的關鍵信號通路〔6〕。N-鈣黏蛋白(N-cadherin)是上皮-間質轉化(EMT)的重要標志分子〔7〕。但TRIM59和Akt、N-cadherin聯合評估與HCC的關系迄今文獻報道罕見。本研究通過免疫組化技術檢測HCC中TRIM59、Akt和N-cadherin的表達情況，探索HCC發生發展、侵襲轉移過程中TRIM59、Akt和N-cadherin的作用，為探索針對TRIM59基因靶向治療HCC提供新的思路。

1 資料和方法

1.1臨床資料 收集2005年2月至2013年2月濱州市人民醫院98例HCC，60例癌旁肝組織，年齡30～80歲。所有患者術前未接受化療、分子靶向或免疫等治療。隨訪通過門診、電話和網絡等方式開展，中位隨訪時間50個月。

1.2試劑和方法 選取濱州市人民醫院病理科存檔的HCC組織蠟塊，高年資病理專業醫師重新進行切片診斷。采用免疫組化(EnVision)法檢測TRIM59、Akt及N-cadherin蛋白表達。兔抗人TRIM59單抗、兔抗人Akt多抗和兔抗人N-cadherin多抗采購于Santa Cruz公司，工作濃度為1∶200。EnVision試劑盒來源于Dako公司。已知陽性切片作為陽性對照，陰性對照用磷酸鹽緩沖液(PBS)。

1.3結果的判定 陽性染色是細胞內出現了黃色的細小顆粒。TRIM59、Akt蛋白定位于細胞質，N-cadherin定位于細胞膜和或細胞質。先判定染色的強度：0，1，2，3分，分別對應無色、淡黃、棕黃、棕褐色。然后計算統計陽性細胞的百分數:1、2、3、4分，分別對應<5%、≥5%且<25%、≥25%且<50%、≥50%且<75%和≥75%。最終取前兩者的乘積，≥4分為免疫反應陽性，<4分為免疫反應陰性。

1.4統計學分析 采用SPSS22.0軟件行χ2檢驗、Spearman相關性分析、Kaplan-Meier法。

2 結 果

2.1HCC和癌旁肝組織中TRIM59、Akt和N-cadherin蛋白的表達 細胞質內出現棕黃或棕褐色為TRIM59、Akt，細胞膜出現黃染為N-cadherin，見圖1。TRIM59在HCC組織中陽性率〔73.5%(72/98)〕明顯高于癌旁肝組織〔11.7%(7/60)〕，差異有統計學意義(χ2=56.859,P=0.000)。HCC組織中Akt的陽性率〔65.3%(64/98)〕明顯高于癌旁肝組織〔13.3%(8/60)〕，差異有統計學意義(χ2=40.528,P=0.000)。HCC組織中N-cadherin的陽性率〔57.1%(56/98)〕明顯高于癌旁肝組織〔16.7%(10/60)〕，差異有統計學意義(χ2=25.067,P=0.000)。

2.2TRIM59、Akt及N-cadherin陽性表達與HCC患者臨床病理參數間的關系 TRIM59、Akt及N-cadherin蛋白的表達與患者年齡、性別、甲胎蛋白(AFP)、腫瘤的大小無明顯相關(P>0.05)。TRIM59、Akt及N-cadherin伴隨腫瘤組織分化較差、血管伴有侵襲、TNM分期進展而表達上調(P<0.05)，見表1。

2.3TRIM59、Akt和N-cadherin在HCC中表達的關系 Spearman等級檢驗結果表明，HCC中TRIM59與Akt表達呈正相關(r=0.427，P=0.031)，TRIM59與N-cadherin表達呈正相關(r=0.391，P=0.041)；Akt與N-cadherin表達也呈正相關(r=0.515，P=0.028)。

2.4生存分析 TRIM59陽性患者與陰性患者的3年總生存期(OS)分別為38%、77%，5年OS分別為21%、55%，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。Akt陽性患者與陰性患者的3年OS分別為67%、54%，5年OS分別為48%及40%，差異無統計學意義(P>0.05)。N-cadherin陽性HCC組患者和陰性HCC組患者3年OS分別為60%、54%，年OS分別為44%和39%，差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 TRIM59、Akt及N-cadherin蛋白的表達與肝癌臨床病理特征的關系〔n(%)〕

圖2 HCC 患者TRIM59陽性表達和生存時間的關系

3 討 論

TRIM家族其他成員如TRIM28、TRIM31等也參與惡性腫瘤增殖、侵襲轉移等〔8,9〕。目前，TRIM59與HCC臨床病理參數的關系文獻報道較少。有文獻報道胃癌中TRIM59高表達，且與TNM分期、預后有關，TRIM59還能降低p53表達調控胃癌侵襲轉移等〔10〕。膽管癌中TRIM59高表達，干擾膽管癌細胞TRIM59后，腫瘤細胞增殖及遷移力明顯下降〔11〕。本研究表明TRIM59與HCC發生發展密切有關。TRIM59蛋白還與病理學分級、腫瘤的分化程度、血管侵犯和TNM分期有關。TRIM59還是一個影響HCC預后因子。以上研究表明TRIM59對HCC臨床診療及預后判斷有一定意義。因此，我們推測TRIM59可能成為HCC治療的靶標。

PI3K與Akt結合后快速轉導細胞內信號〔12〕。LY294002(Akt的阻斷劑)明顯抑制惡性腫瘤細胞過度增殖等〔13〕。本研究發現Akt在HCC中高表達；Akt升高伴隨著HCC病理學分級增加、分化差、血管侵襲明顯和臨床分期更晚，提示Akt參與了HCC惡性侵襲及轉移。HCC中的TRIM59與Akt呈正相關，提示TRIM59和Akt一起參與HCC增殖、侵襲轉移，推斷TRIM59可能通過一些分子機制激活PI3K/Akt通路促進HCC侵襲轉移。

實體惡性腫瘤在侵襲轉移過程中經常發生著上皮-間質轉化(EMT)現象〔14〕。口腔鱗癌中N-cadherin高表達，且高表達與腫瘤分化程度、TNM分期密切相關〔15〕。本研究發現N-cadherin在HCC中的表達率明顯高于癌旁肝組織。N-cadherin與病理學分級、腫瘤的分化程度、血管侵犯和臨床TNM分期具有相關性。TRIM59與Akt、N-cadherin均存在呈正相關，提示HCC中TRIM59、Akt和N-cadherin三者可能協同合作可能性大。