黃連素對(duì)百草枯中毒大鼠急性肺損傷的保護(hù)作用＊

陳文龍 ，舒維 ，湯旭惠 ，肖翔宇 ，傅強(qiáng)

（1.江西省人民醫(yī)院急診科，南昌 330006；2.江西省胸科醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合呼吸科，南昌 330006）

百草枯（PQ）是一種全球廣泛應(yīng)用的除草劑，誤服、皮膚粘膜接觸、氣道吸入等都可造成急性中毒，致死劑量小，是中毒病死率最高的農(nóng)藥。PQ吸收入人體后，在肺內(nèi)聚集，較大劑量可短時(shí)間引起急性肺損傷，呼吸衰竭，多臟器功能損傷。PQ中毒機(jī)制目前普遍認(rèn)為和炎癥爆發(fā)及氧化應(yīng)激等相關(guān)[1]。PQ中毒治療目前無(wú)特效對(duì)抗藥和解毒劑，仍處于探索階段[2，3]。黃連素，主要由中藥黃柏、黃連提取，又稱鹽酸小檗堿（berberine，BBR），具有清熱燥濕、瀉火解毒等功效，具有抑菌作用，廣泛應(yīng)用于腸道感染。近些年，大量研究發(fā)現(xiàn)黃連素在調(diào)節(jié)血糖、血脂、控制心律失常、抑制炎癥反應(yīng)、抗腫瘤等具有顯著效果，對(duì)心臟、腎臟、肝臟具有較強(qiáng)的臟器保護(hù)作用[4，5]。本研究采用黃連素干預(yù)PQ中毒大鼠，探索黃連素對(duì)PQ中毒大鼠急性肺損傷的影響及機(jī)制，以期為PQ中毒治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組 健康雄性SD 大鼠40只，由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部提供，體重為300-400g，普通級(jí)，隨機(jī)分為正常對(duì)照組 （Ctrl）、中毒模型組（PQ）、黃連素低劑量組（PQ+LBBR）、黃連素高劑量組（PQ+HBBR），共4組，每組10只。

1.2 材料 質(zhì)量濃度為20%PQ濃縮液 （上海先正達(dá)有限公司），黃連素（長(zhǎng)春新安藥業(yè)有限公司公司），TNF-α、IL-1β、MDA、SOD、考馬斯亮藍(lán)檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 PQ組、PQ+LBBR組、PQ+HBBR組大鼠，采用PQ一次性灌胃染毒法（40 mg/kg）復(fù)制PQ中毒模型[6]。PQ+LBBR組、PQ+HBBR組大鼠染毒后分別予以40 mg/kg、150 mg/kg黃連素灌胃，1次/d，連續(xù)3d[7]。Ctrl組、PQ組以相等劑量溶媒（0.5%CMC-Na）胃內(nèi)灌入，1 次/d，連續(xù) 3d。

1.4 觀察指標(biāo) 72h后觀察大鼠的一般情況，選用10%水合氯醛（4.5mL/kg）腹腔注射麻醉，大鼠開胸后暴露肺和心臟，取采血針穿刺入心臟，采取5ml血液，留取血漿檢測(cè)TNF-α和IL-1β含量。采集血液后，充分暴露并切開氣管，將灌胃針插入氣管，深度約5mm，予以手術(shù)線固定，采用生理鹽水灌洗，每次2ml，共2次。回收支氣管-肺泡灌洗液（BALF）進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)、測(cè)定蛋白含量。剪下整個(gè)肺臟，觀察肺臟的大體情況，分離大鼠肺組織，取大鼠右肺中葉用4℃生理鹽水沖洗，用濾紙將水吸干，稱濕重（W），然后將肺組織置于80℃烘干48h，稱干重（D），計(jì)算肺W/D比值。切取右肺后葉肺組織打漿、離心，硫代巴比妥酸（TBA）法測(cè)定勻漿內(nèi)MDA含量，黃嘌呤氧化酶（羥胺）法測(cè)定肺組織勻漿內(nèi)SOD活力，取左側(cè)肺組織10%甲醛固定、石蠟包埋、切片、HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠肺組織病理變化。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)結(jié)果用表示，采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS19進(jìn)行分析，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析 （one-way ANOVA），組間兩兩比較應(yīng)用SNK-q檢驗(yàn)，方差不齊選用Dunnett’s T3檢驗(yàn)，以P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)差異。

2 結(jié)果

2.1 72h后大鼠一般情況 Ctrl組大鼠毛發(fā)干凈、光亮、能快速活動(dòng)、呼吸平穩(wěn)、能正常飲食。PQ組大鼠毛發(fā)蓬松、無(wú)光澤、皮膚發(fā)紺、活動(dòng)緩慢、呼吸急促、飲食減少，部分有腹瀉癥狀。PQ+LBBR、PQ+HBBR組大鼠與PQ組相比，其中毒癥狀相對(duì)較輕。

2.2 大鼠血清 TNF-α、IL-1β、及肺組織勻漿MDA、SOD含量變化 與 Ctrl組比較，PQ組中TNF-α、IL-1β及MDA含量明顯高于Ctrl組，SOD含量明顯低于Ctrl組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）； 與 PQ 組比較，PQ+LBBR、PQ+HBBR 組中TNF-α、IL-1β及 MDA含量較PQ組明顯降低，SOD含量明顯增高，有顯著差異 （均P＜0.05）；與PQ+LBBR 組比較，PQ+HBBR 組中 TNF-α、MDA含量較PQ+LBBR組明顯降低，SOD含量明顯增高，差異顯著（均 P＜0.05），見表 1。

表1 大鼠血清TNF-а、IL-6、及肺組織勻漿MDA、SOD含量變化（）

表1 大鼠血清TNF-а、IL-6、及肺組織勻漿MDA、SOD含量變化（）

注：與 Ctrl組比較，# 代表 P＜0.05；與 PQ 組比較，* 代表 P＜0.05；與 PQ+LBBR 組比較，△P＜0.05

TNF-α（ng/L）45.00±4.58 104.10±9.55#93.00±6.93＊82.06±5.85＊△組別IL-1β（ng/L） MDA（nmol/mg） SOD（U/mg）Ctrl PQ PQ+LBBR PQ+HBBR例數(shù)10 10 10 10 153.76±7.43 189.36±9.76#177.919±8.39＊169.30±8.34＊7.10±1.04 14.96±2.03#12.13±1.56＊10.14±1.48＊△25.05±2.39 14.30±1.53#15.97±1.68＊18.32±2.14＊△

2.3 支氣管肺泡灌洗液（BALF）中白細(xì)胞總數(shù)、蛋白含量、肺組織W/D比值比較：PQ組中BALF白細(xì)胞總數(shù)、蛋白含量及肺組織W/D比值明顯高于Ctrl組 （均 P＜0.05）；PQ+LBBR、PQ+HBBR 組中白細(xì)胞總數(shù)、蛋白含量及肺組織W/D比值均明顯低于PQ組（均P＜0.05）；PQ+HBBR組中白細(xì)胞總數(shù)、蛋白含量及肺組織W/D比值均明顯低于PQ+LBBR 組（均 P＜0.05），見表 2。

2.4 肺臟的大體情況 Ctrl組大鼠雙肺表面粉色、無(wú)出血點(diǎn)、未見水腫、觸之光滑、柔軟；PQ組大鼠雙肺表面呈不均勻暗紅色、可見明顯充血水腫、有點(diǎn)狀和片狀出血灶、表面粗糙；PQ+LBBR、PQ+HBBR組雙肺表面可見充血腫脹、少量出血點(diǎn)。

表2 肺泡灌洗液中白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比及蛋白含量變化（）

表2 肺泡灌洗液中白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比及蛋白含量變化（）

注：與 Ctrl組比較，# 代表 P＜0.05；與 PQ 組比較，* 代表 P＜0.05；與PQ+LBBR 組比較，△P＜0.05

組別 例數(shù) BALF WBC（×106）Protein content(mg/L) 肺組織W/D 3.28±0.39 6.57±0.66#5.65±0.58#＊5.01±0.67#＊△Ctrl PQ PQ+LBBR PQ+HBBR 10 10 10 10 87.88±7.45 166.84±13.50#151.86±12.85#＊135.59±9.79#＊△103.97±10.00 219.34±14.36#198.00±15.15#＊178.00±14.49#＊△

2.5 肺組織病理及病理圖 Ctrl肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常；PQ組肺泡水腫充血、肺泡間質(zhì)增厚、肺泡間隙聚集大量炎癥細(xì)胞、毛細(xì)血管充血；PQ+LBBR、PQ+HBBR組肺組織損傷較PQ組減輕，見圖1-4。

肺組織病理圖

圖1 Ctrl組HE*200

圖2 PQ組 HE*200

圖3 PQ+LBBR組HE*200

圖4 PQ+HBBR組 HE*200

3 討論

PQ通過皮膚、黏膜、胃腸道和呼吸道等部位吸收，引起急性肺損傷，呼吸衰竭，PQ中毒機(jī)制尚未明確[1]。大量研究證實(shí)，氧化應(yīng)激是PQ中毒急性肺損傷的主要機(jī)制之一。PQ進(jìn)入肺組織后，經(jīng)NADPH還原作用等生成大量百草枯單陽(yáng)離子自由基（PQ+）、超氧陰離子（O2-）、過氧化氫（H2O2）、羥基等氧自由基。氧自由基通過損傷線粒體膜、脂質(zhì)過氧化損傷細(xì)胞膜，破壞細(xì)胞功能結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[8，9]。本研究發(fā)現(xiàn)黃連素能降低PQ中毒大鼠肺組織勻漿MDA含量，提高肺組織勻漿SOD含量，且較大劑量作用更強(qiáng)，這表明黃連素能抑制PQ中毒肺組織氧化應(yīng)激，且可能呈劑量依賴性。

炎癥爆發(fā)也是PQ中毒急性肺損傷的主要機(jī)制，PQ在肺組織中聚集后刺激巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞釋放大量炎癥因子如TNF-α、IL-1β和干擾素（IFN-γ）等，引發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞聚集，血管通透性增加，引起急性肺損傷[10]。此外，氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)是相互影響和促進(jìn)的[11]。Park，MH等[12]研究發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-1β是炎癥表達(dá)過程中的重要因子。本研究發(fā)現(xiàn)黃連素能降低PQ中毒大鼠血清TNF-α、IL-1β含量，較大劑量作用更明顯，這表明黃連素能抑制PQ中毒急性肺損傷的炎癥反應(yīng)，且可能呈劑量依賴性。

黃連素為傳統(tǒng)中藥黃連、黃柏等的提取物，作為抑菌劑在臨床中廣泛應(yīng)用，且價(jià)格低廉，不良反應(yīng)少。近些年黃連素在抗氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等方面進(jìn)行了廣泛研究。馬競(jìng)等[7]研究LPS誘導(dǎo)的腦損傷大鼠發(fā)現(xiàn)黃連素通過抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、炎癥和NF-細(xì)胞的激活，而對(duì)大鼠腦損傷發(fā)揮保護(hù)作用。Wang，Y等[13]體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)黃連素通過抑制NF-細(xì)胞和IL-6介導(dǎo)的STAT3激活，在脂多糖誘導(dǎo)的膿毒癥中充當(dāng)負(fù)調(diào)節(jié)劑。Jin，JL等[14]實(shí)驗(yàn)證實(shí)黃連素可改善膿毒癥大鼠的心肌損傷和心臟功能，其機(jī)制可能與抑制LPS誘導(dǎo)的TLR4/NF-κB信號(hào)通路的激活并進(jìn)一步減少TNF-α和IL-1β的產(chǎn)生有關(guān)。Li，Z等[15]研究發(fā)現(xiàn)BBR通過PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路抑制PC-12細(xì)胞中的氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙，從而保護(hù)叔丁基氫過氧化物（t-BHP）誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。Kazaz，I O等[16]動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)黃連素通過降低氧化應(yīng)激抑制缺血再灌注引起的大鼠睪丸損傷。本研究采用黃連素干預(yù)PQ中毒大鼠，通過觀察72h后大鼠的一般情況，肺泡灌洗液的白細(xì)胞計(jì)數(shù)和蛋白，肺組織勻漿MDA、SOD含量，血漿TNF-漿和IL-1漿含量，肺組織干濕比值，肺組織病理等指標(biāo)并與對(duì)照組比較。證實(shí)黃連素能減輕PQ中毒大鼠氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，對(duì)急性肺損傷具有保護(hù)作用。

綜上所述，黃連素能減輕PQ中毒大鼠的炎癥反應(yīng)及過氧化損傷，對(duì)PQ中毒大鼠急性肺損傷具有保護(hù)作用，較大劑量組效果更明顯。這為黃連素在新的領(lǐng)域應(yīng)用提供了一定的研究基礎(chǔ)，也為尋找PQ中毒新的治療方法，改善中毒治療效果提供了理論依據(jù)。