外泌體提取及其在糖尿病腎病診治中的研究進展

（湖南省衡陽市南華大學附屬第一醫院，湖南衡陽 421000）

0.引言

糖尿病是威脅著人類生命健康的主要疾病之一[1]。糖尿病患者在終末期會出現嚴重的腎衰竭，其主要原因來自糖尿病腎病，糖尿病腎病早期診斷，能夠影響患者的治療以及預后[2-3]。外泌體最初在研究網織紅細胞向成熟紅細胞轉化的過程中被發現，其來源于晚期內吞體囊泡，在尿液、唾液、腹水以及羊水等體液中，通過投射電子顯微鏡均可檢測到，其直徑約為30nm～100nm，形狀為雙圓盤狀或者杯口狀，粒徑范圍在不同的部位中呈現不同的數值，這些囊泡在最初被認為是細胞產生的垃圾，后來研究發現外泌體包含各種信號分子，能夠加入機體免疫，細胞遷移等過程[4-5]。細胞之間主要通過外泌體進行交流，研究表明，正常細胞和病變細胞分泌出來的外泌體呈現出不同的負載信號分子，能夠影響疾病診斷以及治療[6]。本文以糖尿病腎病患者為例，探討外泌體提取及其在糖尿病腎病診治中的研究進展。

1.外泌體的提取方法

為了能夠充分的研究外泌體的功能，需將其從尿液、血液以及細胞上清液當中提取出來，當前外泌體分離的技術有很多，并衍生出多種提取試劑盒，但能夠對外泌體的純度、含量以及生物活性進行同時監測尚無具體方法[7-8]。

隨著醫療水平的進步，人們在外泌體提取的過程中，逐漸總結了多種方法，主要包括：超速離心法、超濾離心法、凝膠排阻色譜法、聚合物沉淀法、免疫磁珠法以及微流體系法[9]。

外泌體提取的常規方式為超速離心法，是檢驗的金標準。該方法操作較簡單，能夠得到較多的外泌體量，但其耗時長，提取的純度低，極有可能改變外泌體的大小結構[10]。超濾離心法在操作上較為簡單，且用時較短，在過濾的過程中，極易造成外泌體的變形甚至囊泡碎碎，對實驗結果造成嚴重影響[11]。凝膠排阻色譜法是簡單有效的外泌體提取方法，能夠完整的保存外泌體的生物活性以及完整度，但該操作對設備要求較嚴格，所需的時間較長，故不能廣泛應用[12]。目前，微流體系統用來提取外泌體的方法越來越受到人們的青睞，該方式能夠提取到高純度的外泌體，并且，能夠及時地應用于疾病檢測。一些科學家聯合生產的柱形微流控芯片具有極高的靈敏度，能夠分開20nm～110nm的顆粒[13]。2017年，有研究人員提出了新的微流體裝置，即在人體血液中捕獲和釋放外泌體，相對于常規試劑盒，改方法具有更優質的性能。外泌體提取在中國也取得了長足穩定的進步，劉筆鋒教授（華中科技大學）研制出了一種微流體芯片，利用特別拓撲納米材料和識別分子提高了外泌體的提取效率[14]。近期提出了更為高效的提取方式，即通過連續以及無標記的方法，從細胞培養基中進行外泌體提取，達到了外泌體提取量和回收率共同提高的目標[15]。除此之外，來自美國的研究人員通過脂質分子探針對胞外囊泡進行分離，整個過程在15min全部完成，極大地提高了分離速度，且與超高速離心法效率比較，其囊泡成分接近甚至更具優越性[16]。同時該方法與RNA表達以及DNA突變分析等后續分子檢測技術相連接。

2.在糖尿病腎病（DN）的生物標志物

檢測DN的主要方式是通過尿液檢測，其主要標志是尿液總蛋白、miRNA。外泌體具有雙層膜結構的特點，能夠隔離RNA酶與其他內容物，能夠對母細胞進行保護，使其降解作用降低，能夠將母細胞生理狀態和病理狀態充分展示出來，并清晰反應其功能，在準確診斷DN方面，尿外泌體miRNA檢測相較于上述標志具有更大優勢[17]。

2.1 來源蛋白

Gudehithlu的研究表明，相較于全尿分析，外泌體蛋白標志物在DN患者的腎潛在的蛋白變化中，體現的更加準確，能夠以此檢測DN患者的疾病發展情況。研究人員曾對130例II型糖尿病患者展開研究，其尿外泌體亮氨酸氨基肽酶以及二肽基肽酶4同DN的發展程度存在正比關系[18]。有研究指出，通過檢測I型DN患者不同病程的尿液發現，其中多種蛋白酶和蛋白酶抑制劑表達水平出現了明顯的改變。Lou等做出相關研究指出，DN病情的發展影響著尿微泡結合素，能夠作為ND檢測和檢測其發展情況。

2.2 miRNA

外泌體來源miRNA是參與各種生理過程的重要信號分子，在Barutta的研究中指出，糖尿病患者以及微白蛋白尿患者的外泌體miRNA-145以及miRNA-130a水平高于白蛋白尿正常患者。其他相關研究表明，miRNA-192在微量蛋白尿組表達水平顯著增長，但在大量白蛋白尿組呈降低模式，辨明其直接影響著DN的檢測，成為DN早期患者的重要生物標志[19]。

3.外泌體作為藥物載體的研究進展

外泌體能夠作為載體對基因、抗原以及蛋白等種類的藥物進行研究，為腫瘤和感染類疾病的研究做出了重要的貢獻。藥物承載外泌體的主要方式是將母細胞與載體實行共混培養，或者將母細胞實行化學轉染，使母細胞的外泌體含有足夠藥量，但其轉染無法達到較高的效率，同時不能得到較高的基因表達，具有相對明顯的劣勢。除此之外，電穿法、皂化法以及超聲法等。

迄今為止，對外泌體應用在DN疾病的治療方面的研究較少，但其在其他方面的研究已經初見成效，在對DN的治療起到了指導作用[20]。來自墨爾本大學的研究表明，外源蛋白能夠通過晚期結構域來加載至外泌體中，然后向小鼠腦內輸入外源蛋白（具有生物活性），結果表明，在部分腦區域中出現了異常情況，一些被裝入蛋白的外泌體轉運到受體神經元。微流體芯片的設計從根本上增加了外泌體的分離效率[21]。

外泌體已逐漸應用于治療糖尿病的部分疾病。報道指出，外泌體能夠阻止糖尿病腎并發癥的發生。外泌體已經逐漸成為醫學界研究的重要內容，腎細胞外泌體嚴重影響著人類的生命健康，尿外泌體作為腎細胞外泌體的重要部分，成為了多種疾病的生物標志物[22]。不僅能夠快速診斷疾病，而且在腫瘤發展的檢測中，起到了重要的作用，除此之外，其還主要作用于評估疾病的治療效果，預防術后的并發癥，為人類的健康做出極大貢獻。隨著科技水平的不斷進步，外泌體將會以新的姿態為DN患者的治療和預后做出更多的貢獻。

4.結語

提取外泌體的方式很多，但目前尚未發現一種方式能夠在保證含量的同時，達到純度高和保證生物活性的優勢。目前，外泌體生物學標志物在DN中的研究尚未得到廣泛發展，但在DN診斷與病情監測方面突顯出了極大優勢。雖然有關于在DN藥物中應用外泌體作為載體的研究較少，但在相關疾病的治療過程中，作為藥物傳遞系統，具有巨大的研究前景。