新型冠狀病毒SARS-CoV-2的病原學特征及檢測技術研究進展

陳新鵬，董昌金，李文靜，涂俊銘，夏 險

(1.食用野生植物保育與利用湖北省重點實驗室，生物學國家級實驗教學示范中心，湖北師范大學生命科學學院；2.湖北師范大學創新創業學院，湖北 黃石 435002)

0 引言

冠狀病毒(Coronavirus)是一種有包膜、核衣殼和單條正鏈RNA組成病毒[1, 2]。該病毒可感染哺乳動物或者鳥類的呼吸系統，從而引發疾病。最早發現的人類冠狀病毒是HCoV-229E(1966年)和HCoV-OC43(1967年)[1]。科學家們陸續發現了嚴重呼吸道感染病毒SARS-CoV(2003年)、HCoV-NL63(2004年)、HcoV-HKU1(2005年)和中東呼吸道嚴重感染病毒 MERS-CoV(2012年)[2]。HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63和HcoV-HKU1四種冠狀病毒通常只會引起普通感冒癥狀[3]，而SARS-CoV和MERS-CoV則會導致嚴重呼吸道疾病甚至死亡[4]。冠狀病毒基因組包括5’非翻譯區(5’UTR)，復制酶復合體(orf1ab)，刺突S 基因，小包膜E基因，包膜糖蛋白M基因，核衣殼N基因，3’非翻譯區(3’UTR)和幾個未知功能的開放閱讀框組成。

2019年12月初爆發的新型冠狀病毒肺炎，病原體為不同于SARS-CoV和MERS-CoV的嚴重性呼吸綜合征冠狀病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)。其在電子顯微鏡下的形態如圖1所示(http://www.nmdc.cn/nCoV)。自爆發以來，該病毒受到中國政府乃至世界各國和世界衛生組織的高度重視。本文對SARS-CoV-2的發現、病原學特征及檢測技術研究進展等方面進行了綜述。

圖1 SARS-CoV-2電鏡圖(新型冠狀病毒國家科技資源服務系統)

1 病毒的發現

2019年12月初，武漢陸續出現與華南海鮮批發市場相關的肺炎患者，起初被認為與SARS相關，引起湖北省武漢市和國家疾病控制中心的注意；2020年1月1日，華南海鮮批發市場被關閉；2020年1月6日，國家疾病控制中心正式啟動二級響應機制；2020年1月7日，中國疾病控制中心發布此次疫情的爆發由一種新型的冠狀病毒SARS-CoV-2引起，不同于MERS-CoV 和SARS-CoV；2020年1月10日，SARS-CoV-2 的全基因組公布；2020年1月12日，世界衛生組織(WHO)正式將這種新型冠狀病毒命名為2019-nCoV；2020年1月13日，首次在境外(泰國)檢測到SARS-CoV-2的感染患者；2020年1月15日，國家疾病控制中心啟動一級響應機制(最高級別)；2020年1月24日，有報道從患者組織樣品中分離和鑒定了SARS-CoV-2病毒顆粒，并對該病毒進行了表征[5]。2020年1月30日，WHO認定此次疫情為“國際關注的突發公共衛生事件”。2020年2月11日國際病毒分類委員會冠狀病毒研究小組將2019-nCoV正式命名為嚴重性呼吸綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2)。隨著病毒的擴散，疫情逐漸在全世界蔓延開來。

2 病毒的分類地位

冠狀病毒屬于套式病毒目(Nidovirales)、冠狀病毒科(Coronaviridae)，其得名來自于表面的病毒粒子像王冠(拉丁文即corona)[6]。根據系統發育分析，冠狀病毒主要分為α、β、γ和δ四個屬[7]，此前報道的人類冠狀病毒分布在α-冠狀病毒屬(HCoV-229E、HCoV-NL63)、β-冠狀病毒屬(HCoV-OC43、HcoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV)兩大類中[1]。SARS-CoV-2與β-冠狀病毒屬的復制酶保守結構域相似度接近90%，而且系統進化分析和β-冠狀病毒屬特異性基因的擴增結果也表明SARS-CoV-2屬于β-冠狀病毒屬(圖2)[8，9]。

圖2 SARS-CoV-2的進化分析[9]

3 溯源與進化

全基因組公布后，研究者對SARS-CoV-2進行了溯源分析。基于全基因組的進化序列分析表明，SARS-CoV-2與來自蝙蝠的SARS-CoV-like冠狀病毒位于同一分支[8]。利用Beta冠狀病毒基因組中的一個互補回文序列(Nankai complemented palindrome)和其所在的編碼區(Nankai CDS)進行的溯源分析表明SARS-CoV-2可能源自中華菊頭蝠[10]。但是，也有報道基于不同動物物種之間的相對同義密碼子使用偏愛(SCUB)情況進行分析，結果認為蛇可能是SARS-CoV-2病毒的來源[11]。另外，也有研究者通過比較所有宿主在脊椎動物上的病毒傳染模式，提出SARS-CoV-2可能源自水貂[12]。2020年2月7日，華南農業大學發布會稱從穿山甲中分離出的毒株的全基因組與SARS-CoV-2毒株相似度達90.3%[13].隨后，美國研究者基于冠狀病毒S蛋白上的與受體結合Motif的預測表明穿山甲攜帶的毒株與SARS-CoV-2具有高度的相似性[14]。關于SARS-CoV-2的來源，目前大多數研究者偏向源自于蝙蝠，中間宿主可能是穿山甲[15]，傳染途徑如圖3.近期，牛津大學的研究者表示SARS-CoV-2早在2019年爆發前就已潛伏于自然環境中。關于SARS-CoV-2的來源還有待科學界的進一步研究。

圖3 SARS-CoV-2的可能傳染路徑[15]

病毒的突變導致病毒的進化，目前已有國外內多個科研團隊基于不同的角度分析了SARS-CoV-2的進化情況。早期我國研究者基于樣本的突變分析，將病毒分為L型和S型，L型由S型進化而來，更具有傳播性[16]。隨后英國劍橋大學和德國明斯特大學將我國研究者石正麗團隊發現的與SARS-CoV-2高度相似的蝙蝠冠狀病毒作為起源，分析了SARS-CoV-2的突變。結果發現，突變可以分為A、B、C三中類型，其中A型與蝙蝠冠狀病毒關系更近，可能為原始祖先，這類主要分布在美國和澳大利亞；B型由A型演化而來，武漢地區的病例多為B型；C型由B型演化而來，多分布于歐洲地區[17]。目前，關于病毒進化的研究還在不斷繼續，有待進一步的大樣本分析和深入研究。

4 病毒的流行病學及致病性

截止2020年7月5日，我國累計確診85 320例，遍布全國338個城市，其中68 135例(84.99%)在湖北省；全國累計治愈80 161例，其中湖北治愈63 623例(79.36%)；累計死亡4 648例，其中湖北省4 512例(97.07%)。根據世界衛生組織WHO官網數據，目前疫情已蔓延至全球192個國家和地區，累計確診11 500 492例，死亡532 716例[18]。根據中國內地72 314例病例的流行病學特征分析，在確診病例中(44 672例)，大多數年齡在30～79歲(86.6%)、輕/中癥病例為主(80.9%)、粗病死率為2.3%[18，19].有研究者基于基因組分析，發現SARS-CoV-2爆發可能于早于2019年12月[20]。流行病學研究表明，SARS-CoV-2的傳染性更強，具有致使全國甚至全球大流行的潛在風險[21]。更令人憂心的是SARS-CoV-2潛伏期為1～14天，多為3～7天，而且初期癥狀不明顯，因此導致其隱蔽性更強，更容易傳播[22～24]。患者人群早期胸部影響學表現為局部病變，呈斑片狀、亞段或節段性磨玻璃影，伴或不伴小葉間隔增厚；進展期病灶增多、范圍擴大，累及多個肺葉[5，22]。重癥期雙肺彌漫性病變，少數呈“白肺”表現，實變影為主，合并磨玻璃影，多伴條索影，空氣支氣管征[5，22]，如圖4.而且，近期的研究表明SARS-CoV-2的攻擊位點除了呼吸道外，研究者還發現在心臟、食道、膽管、回腸、腎、膀胱、睪丸等器官中均能檢測到SARS-CoV-2受體ACE2的高表達，說明SARS-CoV-2也可能破壞這些器官[25～27]。

圖4 輕癥(A)和重癥(B)新冠肺炎病人的CT圖像[22]

5 病毒檢測技術研究進展

目前，SARS-CoV-2的診斷主要結合流行病學、臨床表現(呼吸道癥狀、醫學影像學、血常規)、病原學證據(核酸檢測)、免疫化學等方法來確定。由于其他病毒性和細菌性肺炎在臨床癥狀和醫學影像學上可能存在重疊，因此選擇不同的檢測方法對于確診來說尤其重要。

5.1 利用核酸檢測病毒

核酸檢測的方法有許多，各有優缺點。基因組測序技術可鑒定未知病原體，準確度高，但是不利于快速大量檢測；巢式反轉錄PCR作為熒光定量的補充，但是檢測效率和普及率低；生物芯片可以批量檢測樣品，但是費用高和設備要求高；逆轉錄環介導的等溫擴增法可以實現現場篩查，但是結果易出現假陽性。逆轉錄數字PCR準確率和靈敏度高，但成本高。目前，核酸檢測主要基于反轉錄熒光定量PCR，該方法靈敏度高、檢測速度快，在病毒檢測方面具有很大的優勢，是目前檢測病毒最常用的手段之一。該方法的步驟如圖5：1)采集有臨床癥狀病人的上呼吸道咽拭子樣本；2)用核酸提取試劑盒提取樣本的核酸；3)反轉錄，將提取的RNA反轉錄為DNA；4)采用定量PCR儀進行PCR擴增；5)在標準范圍內檢測到擴增產物的信號則說明樣本中有新型冠狀病毒的RNA；如果在規定范圍內沒有檢測到擴張增信號，則說明樣本中可能不含新型冠狀病毒的RNA或者含量很低(圖5)[28]。熒光定量RT-PCR涉及到核酸提取，引物特異性、溫度、循環數等很多因素影響，有一定的局限性。

圖5 核酸檢測示意圖[28]

5.2 免疫化學檢測及其他手段

免疫化學手段是主要利用抗原與抗體特異性反應結合對抗原或者抗體定性定量的方法，該方法具有高度特異性和靈敏性。IgG為正常人體血清中最主要的抗體成分，是機體重要的抗菌和抗病毒抗體。IgM是初次體液免疫中最早出現的抗體，具有中和細菌和病毒的功能。當新型冠狀病毒侵入機體后，血清中特異性抗體IgG和IgM含量增高。利用抗體與待檢測病毒抗原相互作用這一特性，因此可以判斷是否存在病毒感染[29]。檢測結果IgG、IgM都為陽性表明處于感染期；IgG為陽性，IgM為陰性時，說明可能處于感染的中晚期；IgG為陰性、IgM為陽性，表明可能是處于感染早期；IgG和IgM都為陰性時，說明是無感染或者處于感染的潛伏期。

常見的免疫化學檢測手段有膠體金免疫層析法、酶聯免疫吸附法(ELISA)、化學發光等方法。膠體金免疫層析法法無需復雜的儀器，操作簡單，可直接目視判定結果，檢測時間只需十幾分鐘，適合于現場快速篩查，但其準確度和靈敏度有限，可以作為SARS-CoV-2核酸檢測的輔助方法。化學發光法具有靈敏度高，特異性強，檢測范圍寬的特點，但依賴于特定的化學發光儀，檢測成本較高。酶聯免疫吸附法靈敏度較高，載體標準化難度較低，但檢測速度慢、易污染、步驟較為繁瑣。在實際應用中，需要根據抗原抗體的特性設計不同的檢測法，目前有雙抗體夾心法、免疫抑制法、競爭法、直接法和間接法等類型。

6 展望

SARS-CoV-2自爆發以來，給人類健康造成重大威脅，引起大家重視。目前，許多科研工作者投入到該病毒的研究中去。各級政府及科研單位都相繼啟動應急科研項目。雖然科研人員研發了檢測病毒毒株的方法，發現部分有效藥物和疫苗，但急需找到該病毒的源頭，切斷其傳染途徑。