酸菜發(fā)酵過程中理化因子及原核微生物群落結構差異分析

楊希，武愛群

(安徽糧食工程職業(yè)學院，安徽 合肥，230011)

酸菜是指蔬菜在低鹽鹽漬的環(huán)境下經(jīng)過發(fā)酵腌制而得到的傳統(tǒng)發(fā)酵食品，通常以白菜為主要原料進行腌制。經(jīng)過發(fā)酵后的酸菜制品，不僅具有酸鮮純正、脆嫩芳香、清爽可口、增進食欲等特點，還提高了原料的營養(yǎng)價值，深受人們喜愛[1]。正是酸菜過程中微生物的多樣性及代謝的復雜變化才造就其酸香可口的口感。在整個發(fā)酵過程中，發(fā)酵液中各項理化指標及微生物群落結構的變化對酸菜品質(zhì)和風味等起著至關重要的作用。為精確調(diào)控發(fā)酵工藝，有必要全面解析發(fā)酵過程中微生物群落結構和化學成分的動態(tài)變化，這對于形成口感俱佳、風味獨特和營養(yǎng)價值高的產(chǎn)品尤為重要[2-3]。

近年來，高通量測序[4-5]技術被廣泛用于研究傳統(tǒng)釀造食品的微生物群落組成。折米娜等[4]采用高通量測序發(fā)現(xiàn)恩施地區(qū)酸菜水中乳桿菌屬的相對豐度可達76.25%，說明乳酸菌是酸菜發(fā)酵最為重要的微生物之一。乳酸菌可能來源于發(fā)酵原料和自然環(huán)境，其可將原料中的小分子糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為酸類化合物，從而賦予酸菜柔和的酸感；部分糖類物質(zhì)被轉(zhuǎn)化為醇類化合物，這些醇類物質(zhì)和酸類代謝物反應形成酯類物質(zhì)，進而賦予產(chǎn)品具有酯香和醇香等特征[6]。乳酸菌通過蛋白水解系統(tǒng)分解發(fā)酵基質(zhì)中的可溶性蛋白形成短肽和氨基酸等小分子，賦予產(chǎn)品獨特的鮮味特征[7]。此外，DU等[8]發(fā)現(xiàn)接種干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei11MZ-5-1)會顯著降低酸菜發(fā)酵過程中細菌的多樣性和豐富度。韓宏嬌等[9]發(fā)現(xiàn)乳酸菌的數(shù)量與pH及可溶性蛋白含量呈顯著負相關，而大腸菌群的數(shù)量與pH、還原糖、可溶性蛋白及氨基酸態(tài)氮含量呈顯著正相關。然而，對原核微生物群落與這些理化因子變化的潛在作用和關系還知之甚少。

本研究利用16S rRNA高通量測序技術揭示酸菜發(fā)酵過程中原核微生物群落的組成和演替，并探究理化因子的變化規(guī)律和不同發(fā)酵時間的標志性微生物。建立理化因子與細菌群落結構之間的典型相關分析(canonical correlation analysis, CCA)和與不同物種之間的相關性分析。旨在探究細菌群落與理化因子之間的相互關系，以期更好地了解酸菜發(fā)酵過程中的菌群變化原因，為精確人工調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

取安徽省某調(diào)味品有限公司2個不同發(fā)酵缸發(fā)酵1、7、14、21、28、35、42 d的酸菜發(fā)酵液，置于-20 ℃下貯藏，待用。

(CH2COO)2Zn、亞鐵氰化鉀、鹽酸萘乙二胺、酒石酸鉀鈉等(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司；乳酸、乙酸、檸檬酸、酒石酸、草酸、蘋果酸、琥珀酸等(色譜純)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；E.Z.N.A.?水樣DNA 提取試劑盒，美國Omega公司；微生物高通量測序建庫試劑盒，北京諾禾致源公司。MinElute?PCR Purification Kit，德國Qiagen公司；Truseq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit，美國Illumina公司。

1.2 儀器與設備

FE28 pH計，瑞士Mettler-Toledo公司；UV-2550紫外可見分光光度計，日本島津公司；5810R高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；1260高效液相色譜儀，美國Agilent公司；Illumina Miseq PE250測序儀，美國Illumina公司；NaneDrop 2000超微量分光光度計，美國Thermo公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 理化性質(zhì)分析

用pH計測定酸菜發(fā)酵液樣品的pH值；使用滴定法測定總酸含量[10]；采用斐林試劑滴定法測定還原糖含量[11]；采用鹽酸萘乙二胺法測定亞硝酸鹽含量[12]；使用甲醛滴定法測定氨基酸態(tài)氮含量[13]。

采用高效液相色譜儀檢測有機酸含量。取適量酸菜發(fā)酵液，加入等體積的ZnSO4和亞鐵氰化鉀，搖勻，10 000 r/min離心20 min，保留上清液過0.45 μm水系濾膜后待用。色譜條件：進樣量10 μL；流動相為0.02 mol/L的NaH2PO4溶液；柱流速 0.7 mL/min；檢測波長210 nm；柱溫30 ℃。

1.3.2 DNA提取與Illumina高通量測序

使用E.Z.N.A.?水樣DNA 提取試劑盒提取酸菜液樣品中微生物的基因組DNA。使用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)進行聚合酶鏈式反應(polymerase chain reation，PCR)擴增，擴增體系(20 μL)包括模板DNA 10 ng，正向及反向引物各 10 pmol/L，2×Phusion Master Mix 10 μL。擴增程序參考沈毅等[14]的方法，擴增產(chǎn)物使用2%(質(zhì)量分數(shù))的瓊脂凝膠進行電泳檢測。使用MinElute?PCR Purification Kit對PCR擴增產(chǎn)物進行純化。利用Truseq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit制備測序文庫并添加接頭序列，經(jīng)NaneDrop 2000確定文庫質(zhì)量，使用Illumina Miseq PE250測序平臺進行高通量測序。

1.3.3 測序數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計學分析

采用FLASH軟件[15]對測序的原始數(shù)據(jù)進行拼接，利用QIIME軟件[16]對低質(zhì)量的拼接序列進行過濾，使用UCHIME軟件[17]去除嵌合體，得到優(yōu)質(zhì)序列。根據(jù)UCLUST軟件[18]在相似性97%的水平上對優(yōu)質(zhì)序列進行聚類，得到各可操作分類單元(operational taxonomic unit, OTU)，以各OTU中豐度最高的序列作為代表序列。在80%置信水平下，通過Silva 132數(shù)據(jù)庫[19]對OTU進行分類學注釋，將藍藻門和不能注釋到門水平的OTU刪除。利用QIIME軟件[16]對樣品進行多樣性分析。基于OTU列表的主成分分析、樣本聚類分析、CCA和各OTU與理化因子的pearson相關性分析均通過R軟件實現(xiàn)。酸菜樣本理化因子之間的差異顯著性分析通過SPSS方差分析(ANOVA)實現(xiàn)。

2 結果與分析

2.1 酸菜發(fā)酵過程中理化因子變化

理化因子是決定酸菜產(chǎn)品品質(zhì)的重要因素之一。圖1是酸菜發(fā)酵過程中pH和總酸的變化情況，發(fā)酵1～14 d，發(fā)酵液的pH值快速降低，從pH值6.47下降至4.28；隨后pH值隨發(fā)酵時間的延長而緩慢下降，于發(fā)酵42 d穩(wěn)定在3.68。此外，總酸含量則隨著發(fā)酵時間而持續(xù)上升，在發(fā)酵35 d達到穩(wěn)定，可達9.88 g/L。酸性環(huán)境會抑制不耐酸有害菌的生長，可促進部分抗酸乳酸菌的繁殖，導致總酸含量持續(xù)增加[20]。而在發(fā)酵35 d之后，發(fā)酵環(huán)境中的碳源和氮源被大量消耗而不足，造成微生物群落結構和數(shù)量趨于穩(wěn)定，使發(fā)酵環(huán)境中總酸含量趨于穩(wěn)定。

圖1 酸菜發(fā)酵過程中pH和總酸含量的動態(tài)變化Fig.1 Dynamic changes of pH and total acid content during the fermentation of sauerkraut

還原糖是促進微生物生長繁殖的主要能源物質(zhì)之一。由圖2可知，還原糖含量在整個酸菜發(fā)酵過程中持續(xù)下降。發(fā)酵1～21 d，發(fā)酵液的還原糖含量快速降低，由2.22%下降至0.51%；隨后緩慢降低，于發(fā)酵35 d達到穩(wěn)定，其還原糖含量維持在0.01%(體積分數(shù))左右。結果表明，微生物降解還原糖主要發(fā)生在發(fā)酵1～21 d。說明較高的還原糖含量可為微生物提供了豐富的營養(yǎng)來源，使其大量繁殖，進一步將還原糖轉(zhuǎn)化為酸、醇和酯等風味物質(zhì)[21]。

酸菜屬于腌制食品，在腌制初期，酸菜及發(fā)酵器具上攜帶的腸桿菌和黃桿菌屬等革蘭氏陰性菌會分泌硝酸還原酶，從而將酸菜中的大量硝酸鹽還原為亞硝酸鹽[22]。如圖2所示，發(fā)酵液中亞硝酸鹽含量在整個發(fā)酵過程中呈先上升后下降的趨勢，于發(fā)酵14 d達到最大值，可達到50.73 mg/L。這個結果與ZHOU等[23]研究結果一致。亞硝酸鹽含量在發(fā)酵35～42 d達到穩(wěn)定，維持在2.02 mg/L左右，其含量遠低于國標規(guī)定泡菜中的亞硝酸鹽含量為20 mg/L的限量標準[24]。

圖2 酸菜發(fā)酵過程中還原糖和亞硝酸鹽含量的動態(tài)變化Fig.2 Dynamic changes of reducing sugar and nitrite content during the fermentation of sauerkraut

有機酸是指示酸菜發(fā)酵進程的一個重要指標。監(jiān)測了乳酸、乙酸、檸檬酸、草酸、蘋果酸、琥珀酸和酒石酸在整個發(fā)酵過程的變化規(guī)律。由表1可知，在發(fā)酵1 d時，只檢測到了檸檬酸、草酸和琥珀酸這3種有機酸，但隨著發(fā)酵的不斷進行，這3種有機酸的含量也在逐漸增加，其在發(fā)酵42 d時可分別達到2 162.03、913.84和293.12 mg/L。此外，在發(fā)酵42 d時還檢測到乳酸、乙酸、蘋果酸和酒石酸，這些有機酸含量在整個發(fā)酵過程也呈增加的趨勢，其中乳酸含量增加最顯著，在發(fā)酵42 d時質(zhì)量濃度可達9 087.35 mg/L，占整個有機酸比例的64.14%。說明乳酸是影響酸菜口感的主要有機酸，其含量及比例決定了酸菜的品質(zhì)。馬藝熒等[25]發(fā)現(xiàn)乳酸在東北酸菜酸感形成過程中起主導作用，檸檬酸、乙酸、草酸、蘋果酸、琥珀酸及酒石酸則起到輔助作用，且這些有機酸含量及比例合適時對酸菜柔和酸感起到促進作用，而含量及比例不合適時會破壞柔和酸感。

表1 酸菜發(fā)酵過程中有機酸的動態(tài)變化 單位:mg/L

2.2 酸菜發(fā)酵過程中原核微生物多樣性分析

利用Illumina Miseq高通量測序技術可得到679 020條優(yōu)質(zhì)序列，平均42 581 ～ 53 062條/樣本。根據(jù)樣本的最低序列數(shù)對所有樣本進行抽平，抽平后進行后續(xù)分析。通過OTU聚類(97%相似度)后可得到105個OTU，OTU平均65～95個/樣本。每個樣本的測序覆蓋率>97%，說明測序數(shù)目足夠，測序序列可以代表其菌群組成。Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Richness指數(shù)和Pielou指數(shù)是評價群落多樣性、豐富度和均勻度的常用指數(shù)。由表2可知，發(fā)酵1 d時，樣本中細菌的Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Pielou指數(shù)均最高，說明在發(fā)酵初始時群落的多樣性和均勻度最高。結果說明酸菜、發(fā)酵器具及發(fā)酵環(huán)境中含有大量的細菌，可能正是這些細菌促進了酸菜發(fā)酵。隨著發(fā)酵的不斷進行，Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Pielou指數(shù)均逐漸下降。說明酸性環(huán)境會抑制大部分微生物的生長繁殖，但會促進某些耐酸微生物的增殖，增加其在群落中的比例，從而造成微生物多樣性和均勻度均下降。而Richness指數(shù)在整個發(fā)酵過程中呈先下降后上升的趨勢，說明有些微生物只能在特定的環(huán)境下才能激活其生長繁殖，而在其他環(huán)境下可處于休眠的狀態(tài)。

表2 酸菜發(fā)酵過程中原核微生物群落序列數(shù)量和多樣性參數(shù)Table 2 Sequence numbers and diversity indices of prokaryotic microbial communities during the fermentation of sauerkraut

根據(jù)原核微生物群落信息對14個酸菜樣本進行聚類分析。如圖3所示，發(fā)現(xiàn)2個不同發(fā)酵缸的原核微生物群落變化具有一致性，說明酸菜發(fā)酵具備批次穩(wěn)定性。穩(wěn)定的微生物群落變化造就了產(chǎn)品口感、品質(zhì)和功能的穩(wěn)定。此外，對14個酸菜樣本的OTU列表進行主成分分析。由圖4所示，這些樣本在第1主成分(90.94%)的差異非常明顯，而在第2主成分(6.52%)的差異卻很小。說明某些OTU是主導著整個發(fā)酵的變化，驅(qū)動著發(fā)酵不斷進行。

圖3 酸菜發(fā)酵過程中樣本的層次聚類Fig.3 Hierarchical clustering of samples during the fermentation of sauerkraut

圖4 酸菜發(fā)酵過程中菌群OTU組成的主成分分析Fig.4 Cluster analysis of the OTU composition of samples based on principal component analysis during the fermentation of sauerkraut

2.3 酸菜發(fā)酵過程中原核微生物結構和演替分析

如圖5所示，根據(jù)數(shù)據(jù)庫注釋結果，可將OTU分為5個不同的門，分別為放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、Patescibacteria和變形菌門(Proteobacteria)。擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門在整個酸菜發(fā)酵過程占絕對優(yōu)勢，其相對豐度之和>98%。在發(fā)酵過程中，擬桿菌門和變形菌門的相對豐度持續(xù)降低，分別從19.19%和61.15%下降至低于0.01%和2.11%。而厚壁菌門則在發(fā)酵過程中逐漸增加，其相對豐度從16.73%增加至97.85%。說明厚壁菌門對酸菜發(fā)酵起主導作用。

圖5 酸菜發(fā)酵過程中原核微生物群落在門水平的分布Fig.5 Distribution of prokaryotic microbial communities in samples at phylum level during the fermentation of sauerkraut

發(fā)酵1 d的樣本中細菌群落組成與其他樣本差異顯著。從圖6可知，發(fā)酵1 d的樣本中平均相對豐度超過1%的優(yōu)勢屬為不動桿菌屬(Acinetobacter)、柄桿菌屬(Caulobacter)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、腸球菌屬(Enterococcus)、愛文氏菌屬(Ewingella)、乳球菌屬(Lactococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、泛菌屬(Pantoea)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、沙雷氏菌屬(Serratia)、鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)和Stenotrophomonas，其種類遠多于其他發(fā)酵時期，說明多種微生物調(diào)節(jié)著酸菜發(fā)酵的啟動。其中鞘氨醇桿菌屬的平均相對豐度最高，可達14.71%，其次分別為假單胞菌屬(13.68%)和乳球菌屬(10.94%)。鞘氨醇桿菌屬和乳球菌屬均廣泛存在于我國的傳統(tǒng)發(fā)酵食品，而假單胞菌屬存在于新鮮蔬菜中，生存能力強，適應環(huán)境范圍廣[26]。隨著發(fā)酵的不斷進行，具有耐酸且厭氧特性的微生物可在該環(huán)境中迅速生長繁殖，并占領足夠多的生態(tài)位，而不耐酸的微生物的生長則受到抑制。有趣的是，乳桿菌屬(Lactobacillus)的平均相對豐度從0.11%增加至81.45%，說明酸菜發(fā)酵過程中乳桿菌屬起著主導作用。此外，鹽單胞菌屬(Halomonas)、魏斯氏菌屬(Weissella)和片球菌屬(Pediococcus)的平均相對豐度均在酸菜發(fā)酵過程中持續(xù)增加。其中鹽單胞菌屬從0.03%增加至1.59%；魏斯氏菌屬從0.13%增加至4.68%；片球菌屬從0.04%增加至3.23%。說明這些微生物可以和乳桿菌屬互利共生。鹽單胞菌屬和片球菌屬具有耐鹽的特性，能分解葡萄糖，產(chǎn)生多種風味物質(zhì)，推測它的存在與生產(chǎn)酸菜“鹽漬”這一步驟有關[27]。魏斯氏菌屬廣泛存在與含鹽的發(fā)酵食品中，可參與生成醛、醇和酮等揮發(fā)性風味物質(zhì)，還可使發(fā)酵食品的顏色更鮮亮、口感更醇厚[28]。

圖6 酸菜發(fā)酵過程中原核微生物群落在屬水平的分布Fig.6 Distribution of prokaryotic microbial communities in samples at genus level during the fermentation of sauerkraut

2.4 酸菜發(fā)酵過程中不同發(fā)酵時間標志性微生物分析

線性判別分析效應大小(linear discriminant analysis effect size，LEfSe)分析是一種用于發(fā)現(xiàn)和解釋高維度數(shù)據(jù)生物標識的分析工具，用于發(fā)現(xiàn)不同生物條件或環(huán)境下的2組或多組樣本中最能解釋組間差異的物種特征，以及這些特征對組間差異的影響程度。因此，LEfSe分析有助于鑒定出不同發(fā)酵時間的標志性微生物。根據(jù)圖7可知，發(fā)酵1 d的樣本中的標志性微生物最多，共有18個，表明該日的微生物群落與其他發(fā)酵時間的群落差異顯著。這些標志性微生物分別來自在Weeksellaceae，鞘氨醇桿菌目(Sphingobacteriales)、根瘤菌目(Rhizobiales)、Sphingomodales、腸桿菌目(Enterobacteriales)和Pseudomodales。而其他發(fā)酵時間的標志性微生物則都來自乳桿菌目(Lactobacillales)。

圖7 酸菜發(fā)酵過程中不同發(fā)酵時期生物標志性微生物的分析Fig.7 Analysis of biomarker microorganism in different stage during the fermentation of sauerkraut

2.5 酸菜發(fā)酵過程中理化因子與原核微生物的相關性分析

酸菜發(fā)酵過程中理化因子和原核微生物群落之間的CCA如圖8所示，前2個成分可以解釋89.29%微生物菌群的變異。pH和還原糖含量只有與發(fā)酵1 d和7 d的樣本菌群呈正相關，與其他發(fā)酵時間的菌群呈負相關，表明這些樣本中pH和還原糖含量相對其他樣本較高。原因是由于發(fā)酵初期乳酸菌的生長處于劣勢，發(fā)酵環(huán)境中產(chǎn)酸較少，但隨著發(fā)酵的進行，乳酸菌在厭氧環(huán)境中利用原料中的還原糖生長繁殖，并代謝產(chǎn)生大量的酸性物質(zhì)，使pH和還原糖含量不斷降低。總酸含量和檢測到的有機酸含量與發(fā)酵1 d和7 d的樣本菌群呈負相關，而與其他發(fā)酵時間的菌群呈正相關，說明乳酸菌是酸菜發(fā)酵過程的優(yōu)勢微生物和產(chǎn)酸主要微生物。有趣的是，亞硝酸鹽含量只與發(fā)酵14 d和21 d的樣本菌群呈正相關，說明乳酸菌會抑制腸桿菌和黃桿菌屬等微生物的生長代謝，從而降低酸菜中亞硝酸鹽的含量。這個發(fā)現(xiàn)與ZHOU等[23]的研究結果一致。

圖8 酸菜發(fā)酵過程中理化因子與原核微生物菌群之間的CCA關系圖Fig.8 Canonical correlation analysis between physicochemical factors and prokaryotic microbial communities during the fermentation of sauerkraut注：箭頭表示理化因子與微生物群落結構之間關聯(lián)性的方向與大小；箭頭的長度代表相關性的大小，中心點樣本菌群點之間的連線與箭頭的夾角，銳角表示菌群與相應的理化因子呈正相關，鈍角表示負相關

為全面了解微生物與理化因子之間的關系，將酸菜自然發(fā)酵過程中理化因子與主要屬水平微生物進行相關性分析。為了降低錯誤率，只保留相關系數(shù)(|r|>0.6)和具有顯著性(P<0.05)的值。如圖9所示，乳桿菌屬與總酸和各種有機酸呈正相關，而與pH和還原糖呈負相關。這個結果與韓宏嬌等[9]研究結果一致。此外，腸球菌屬、鹽單胞菌屬、片球菌屬和魏斯氏菌屬與理化因子之間的相關性和乳桿菌屬是一致的，而其他微生物卻呈現(xiàn)相反的趨勢。亞硝酸鹽與乳酸乳球菌和明串珠菌屬呈正相關，說明乳酸乳球菌和明串珠菌屬是酸菜發(fā)酵的啟動微生物。

圖9 酸菜發(fā)酵過程中理化因子與屬水平原核微生物之間的相關性圖Fig.9 Correlation analysis between physicochemical factors and prokaryotic microbial communities in genes level during the fermentation of sauerkraut注：外部圓圈表示不同屬水平微生物，內(nèi)部菱形表示理化因子，紅色的線表示該屬水平微生物與相應的理化因子呈正相關，綠色的線表示呈負相關

3 結論

本研究利用16S rRNA高通量測序技術揭示酸菜發(fā)酵過程中原核微生物群落的組成和演替規(guī)律，分析微生物群落演替過程中理化因子的變化。隨發(fā)酵時間的延長，pH和還原糖含量下降，總酸含量上升，而亞硝酸鹽含量呈先增后減的變化趨勢，原核微生物群落的多樣性和均勻性均減少。相比發(fā)酵初期的原核微生物群落，其他發(fā)酵時間不僅群落差異顯著而且標志性微生物較少。乳桿菌屬是發(fā)酵過程中處于絕對優(yōu)勢微生物，其相對豐度從0.11%增加至81.45%。此外，相關性分析表明，發(fā)酵初期的群落與pH及還原糖含量呈正相關，發(fā)酵中期的群落與亞硝酸鹽含量呈正相關，而發(fā)酵后期的群落與總酸、乳酸、乙酸、酒石酸、琥珀酸、檸檬酸、草酸和蘋果酸含量呈正相關，乳桿菌屬與pH和還原糖含量呈負相關。綜上所述，本研究深入解析酸菜發(fā)酵過程中菌群的演替并分析其驅(qū)動因素，為精確人工調(diào)控提供理論依據(jù)。