非小細胞肺癌中CDO1、RASSF1A和SHOX2基因甲基化的應用

馬曉陽，張 爽，江澤友

肺癌是我國發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤[1]。其中，非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)是肺癌中最常見的類型，其侵襲性強，預后差[2]。2011年美國國立癌癥研究所研究報道顯示，對肺癌高危人群進行低劑量CT檢查較普通X線胸片可使肺癌病死率降低20%，但假陽性率高達96.4%[3]。而肺組織活檢為侵入性檢查，嚴重肺氣腫、出血性疾病及嚴重凝血功能障礙等患者不宜采用，且腫瘤異質(zhì)性使局灶取樣結果存在偏差[4]。隨著基因組學和表觀遺傳學的深入發(fā)展，基因甲基化與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關系已成為研究熱點。甲基供體在DNA甲基轉移酶的作用下，將甲基基團轉移到DNA上，以CpG二核苷酸中胞嘧啶第5位碳原子上最常見，形成5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine, 5mC)[5]。甲基化的DNA具有更好的穩(wěn)定性，能夠阻止轉錄因子與之結合，導致基因低表達或不表達[6]。在人類基因組中，約80%的CpG二核苷酸是甲基化的，而20%未甲基化的CpG二核苷酸常位于基因啟動子區(qū)。研究表明，DNA啟動子區(qū)異常甲基化在腫瘤中普遍存在，是腫瘤發(fā)生過程中最早的變化之一。作者查閱大量相關文獻對NSCLC常見甲基化基因進行整理和預試驗，最終選擇半胱氨酸雙加氧酶1(cysteine dioxygenase type 1, CDO1)、Ras相關結構域家族基因1A(Ras association domain family member 1A, RASSF1A)和人矮小同源盒基因2(short stature homeobox 2, SHOX2)三基因進行探究。探索CDO1、RASSF1A和SHOX2在NSCLC中的潛在診斷價值，為NSCLC的早期診斷提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2018年1月～2019年4月成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院確診為NSCLC的組織樣本55例，同期選取55例肺部良性病變組織樣本作為對照組。所有樣本均為石蠟包埋組織，并由臨床經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)師復查確診。其中，NSCLC患者男性31例，女性24例，年齡37～80歲，中位年齡60歲。肺部良性病變?yōu)闅庑睾吐宰枞苑渭膊。渲心行?2例，女性23例，年齡18～70歲，中位年齡41歲。所有患者術前均未行放、化療。

1.2 DNA提純每個石蠟組織塊5～10 μm厚切片5～8張，裝入1.5 mL已消毒的離心管中。石蠟組織DNA提取按照石蠟包埋組織DNA快速提取試劑盒(天根生化科技有限公司)步驟提取DNA，最后以50 μL洗脫液洗脫DNA。用微量紫外-可見光分光光度計(Thermo Scientific公司)測定所提取的DNA濃度。

1.3 亞硫酸鹽轉化按照EZ DNA Methylation Gold Kit試劑盒(Zymo Research公司)說明書進行操作，每測試投入約500 ng提純的DNA樣本進行亞硫酸鹽轉換及純化。最后用30 μL洗脫緩沖液進行洗脫，洗脫后的DNA立即用于后續(xù)試驗或置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 定量甲基化特異性PCR(quantitative methylation specific PCR, QMSP)采用QMSP技術對CDO1、RASSF1A和SHOX2基因啟動子區(qū)甲基化進行檢測，針對亞硫酸鹽轉換后的DNA序列設計引物及探針。引物及探針序列、退火溫度和產(chǎn)物長度見表1，引物探針由上海生工生物公司合成。PCR反應同時擴增內(nèi)參基因和待測基因。QMSP反應體系：總體積20 μL，包括2 μL DNA模板(亞硫酸鹽轉化后)，1×Super Real Pre Mix(天根生化公司)，0.2 μmol/L正、反向引物，0.15 μmol/L Taqman探針，ddH2O補齊至20 μL。PCR擴增循環(huán)參數(shù)：45個循環(huán)，預變性95 ℃ 15 min，變性95 ℃ 3 s，60 ℃退火/延伸20 s。其中，內(nèi)參基因為ACTB。

表1 QMSP反應引物探針序列、產(chǎn)物長度及退火溫度

1.5 結果判斷根據(jù)臨床對于檢測靈敏度和特異度的需求分析，判定甲基化基因的截斷值Ct值為40，且內(nèi)參基因的Ct值≤36，測試結果才有效[7]。詳細判定方式：(1)ACTB基因的Ct值≤36，甲基化基因Ct值≤40時判斷樣本為陽性；(2)ACTB基因的Ct值≤36，甲基化基因Ct值>40時判斷樣本為陰性；(3)ACTB基因的Ct值>36或者無Ct值時，判定樣本不合格，不能將其納入統(tǒng)計。

1.6 統(tǒng)計學分析所有數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學處理。不同組別間的比較采用χ2檢驗，甲基化檢出率與臨床病理特征的相關性分析采用Fisher精確檢驗法。構建受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic, ROC)，并計算曲線下面積(area under curve, AUC)。敏感性=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))，特異性=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))。所有P值均取雙側，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 NSCLC組織中CDO1、RASSF1A和SHOX2基因甲基化檢出率NSCLC組織中CDO1、RASSF1A和SHOX2基因甲基化的檢出率分別為85.45%(47/55)、41.82%(23/55)和29.09%(16/55)。對照組中CDO1、RASSF1A和SHOX2基因甲基化的檢出率分別為5.45%(3/55)、9.09%(5/55)和3.64%(2/55)。NSCLC組與對照組甲基化檢出率相比，CDO1(χ2=70.987，P<0.001)、RASSF1A(χ2=15.523，P<0.001)和SHOX2(χ2=13.019，P<0.001)甲基化在NSCLC中均更易被檢測到，差異有統(tǒng)計學意義(圖1)。

圖1 非小細胞肺癌組和對照組基因甲基化檢出率分析：A.CDO1；B.RASSF1A；C.SHOX2；*P<0.001

2.2 CDO1、RASSF1A和SHOX2基因甲基化與NSCLC臨床病理特征的關系NSCLC組織中CDO1、RASSF1A和SHOX2基因甲基化檢出率與患者年齡、性別、組織學類型、分化程度以及TNM分期均無關(P>0.05，表2)。

表2 CDO1、RASSF1A和SHOX2基因甲基化檢出率與非小細胞肺癌臨床病理特征的相關性分析[n(%)]

2.3 CDO1、RASSF1A和SHOX2基因甲基化對NSCLC的診斷價值評估應用ROC曲線評估CDO1、RASSF1A和SHOX2基因甲基化在NSCLC中的診斷價值。CDO1基因甲基化區(qū)分NSCLC組和對照組的AUC為0.920 0(95%CI=0.861 7～0.978 3，P<0.001)，敏感性為85.45%(95%CI=72.78%～93.07%)，特異性為94.55%(95%CI=83.93%～98.58%)；RASSF1A基因甲基化區(qū)分NSCLC組和對照組的AUC為0.672 1(95%CI=0.570 4～0.773 7，P=0.002)，敏感性為41.82%(95%CI=28.93%～55.85%)，特異性為90.91%(95%CI=79.29%～96.60%)；SHOX2基因甲基化區(qū)分NSCLC組和對照組的AUC為0.641 5(95%CI=0.537 4～0.745 6，P=0.011)，敏感性為29.09%(95%CI=18.02%～43.09%)，特異性為96.36%(95%CI=86.39%～99.37%)(圖2)。

圖2 CDO1、RASSF1A和SHOX2基因甲基化在非小細胞肺癌中的診斷價值：A.CDO1；B.RASSF1A；C.SHOX2

3 討論

肺癌是全球腫瘤相關死亡的主要原因，其中約85%的確診病例為NSCLC，組織學類型主要包括腺癌和鱗癌[8]。NSCLC目前缺乏理想的早期篩查手段，故尋找敏感且特異的NSCLC早期診斷標志物對降低肺癌患者的病死率具有重要的臨床意義。隨著基因檢測技術的發(fā)展，分子標志物被廣泛應用于腫瘤臨床診斷、精準治療和預后評估。研究表明基因甲基化在腫瘤中具有普遍性和早期性，因此基因甲基化是早期診斷腫瘤的理想分子標志物[9]。此前，已有許多研究者在NSCLC患者的痰液、支氣管肺泡灌洗液和血清中檢測到基因啟動子區(qū)CpG島高度甲基化[10-12]。與傳統(tǒng)的蛋白標志物相比，基因甲基化具有更高的敏感性和特異性，提示基因甲基化有望成為篩查NSCLC的分子標志物。目前已有大量文獻報道CDO1、RASSF1A和SHOX2在肺癌、乳腺癌、結直腸癌及口腔癌等多種腫瘤中存在表達失活，且啟動子區(qū)高度甲基化是其功能失活的主要機制[13-16]。CDO1基因位于染色體5q23.2處，編碼一種非血紅素結構的含鐵金屬酶，可調(diào)節(jié)半胱氨酸與谷胱甘肽的合成。CDO1是牛磺酸生物合成途徑的關鍵酶之一，對牛磺酸的生物合成起關鍵作用[17]。RASSF1A基因位于3p21.3，是Ras信號通路的成員，參與細胞周期調(diào)節(jié)和誘導細胞凋亡等細胞生理功能[18]。研究顯示，RASSF1A表達減少在大鼠肺腺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[19]。SHOX2基因定位于3q25-q26.1，編碼含有60個氨基酸殘基的DNA結合結構域，是一種轉錄調(diào)節(jié)因子。本實驗主要分析CDO1、RASSF1A和SHOX2基因甲基化在NSCLC組織中的檢出率，從而尋找適合NSCLC早期篩查的分子標志物，為后續(xù)研究奠定基礎。

本實驗采用QMSP法檢測CDO1、RASSF1A和SHOX2基因甲基化在NSCLC組和對照組中的發(fā)生情況，結果顯示CDO1、RASSF1A和SHOX2基因甲基化在NSCLC組中的檢出率分別為85.45%(47/55)、41.82%(23/55)和29.09%(16/55)；在對照組中的檢出率分別為5.45%(3/55)、9.09%(5/55)和3.64%(2/55)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。因此CDO1、RASSF1A和SHOX2基因甲基化是腫瘤相關或腫瘤特異性的，提示其可能在NSCLC的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，同時為靶向治療的研究提供新思路和新方向。此外，CDO1、RASSF1A和SHOX2基因甲基化檢出率與NSCLC患者年齡、性別、組織學類型、分化程度以及TNM分期均無關(P>0.05)，說明CDO1、RASSF1A和SHOX2基因甲基化可能是NSCLC發(fā)生的早期事件，而與NSCLC的進展無關。CDO1基因甲基化區(qū)分NSCLC組和對照組的AUC為0.920 0，敏感性為85.45%，特異性為94.55%；RASSF1A基因甲基化區(qū)分NSCLC組和對照組的AUC為0.672 1，敏感性為41.82%，特異性為90.91%；SHOX2基因甲基化區(qū)分NSCLC組和對照組的AUC為0.641 5，敏感性為29.09%，特異性為96.36%。因此，CDO1基因甲基化是篩查NSCLC的更有效的潛在分子標志物，可為NSCLC的早期診斷提供新手段。

QMSP法是以特異性的引物和探針檢測基因CpG島的胞嘧啶是否發(fā)生甲基化。該方法檢測結果準確、靈敏度高，與Sanger測序結果呈高度一致性[11]。QMSP也被稱為Methylight，是一種依賴亞硫酸鹽轉換和基于實時熒光定量的PCR方法[20]。QMSP的原理是利用亞硫酸鹽使未甲基化的胞嘧啶轉換為尿嘧啶，在PCR擴增過程中，再轉換為胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變。因此針對修飾前后的序列差異設計特異性引物和探針從而實現(xiàn)區(qū)分甲基化和未甲基化的序列。QMSP方法方便簡單，在PCR反應后無需任何操作即可快速判斷，適用于大量樣本的快速檢測和臨床體外診斷。

綜上，CDO1、RASSF1A和SHOX2基因甲基化對NSCLC均具有一定的診斷價值，但CDO1基因甲基化是篩查NSCLC更有效的潛在分子標志物，故CDO1基因甲基化是課題組未來研究的核心方向。由于獲得支氣管肺泡灌洗液對患者創(chuàng)傷性較小以及診斷肺部疾病的敏感性和特異性高，后續(xù)實驗會將本組結果應用到支氣管肺泡灌洗液，進一步探討CDO1基因甲基化在NSCLC中的早期診斷價值。