水動力尾靜脈注射介導Akt/β-catenin/Yap質粒轉染建立小鼠肝癌模型

蔣雨薇，宋海燕,2，李怡萍，湯凱悅，徐嬌雅，SULAIMAN Andrew，MCGARRY Sarah，WANG Lisheng，鄭培永,2

原發性肝癌是一種常見的惡性腫瘤，流行病學統計顯示我國肝癌發病率及病死率均較高，發病率位居惡性腫瘤的第3位[1]。肝癌具有惡性程度高、病情進展迅速等特點。目前仍然缺乏有效的治療藥物，大部分患者預后差[2]。建立恰當的動物模型是研究肝癌治療方法的基礎和前提[3]。水動力尾靜脈注射(hydrodynamic tail vein injection, HTVi)聯合Sleeping Beauty(SB)質粒轉座子可介導一種或幾種促癌基因整合到肝細胞中，肝細胞穩定表達促癌基因從而形成肝癌。既往研究顯示蛋白激酶B(protein Kinase B, PKB)或Akt、β-catenin、轉錄共激活因子相關蛋白(yes-associated protein, Yap)在肝癌組織中表達顯著增加，是肝癌促癌基因[4-6]。本文通過給予C57BL/6J小鼠尾靜脈水動力高壓注射SB質粒及Akt/β-catenin/Yap促癌基因質粒的方法構建肝癌動物模型，為肝癌研究提供了新的有價值的動物模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物C57BL/6J小鼠，SPF級，6周齡，雄性，共10只，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號SCXK(滬)2007-0005。小鼠飼養于室溫(22±3)℃、相對濕度50%～70%的環境中。動物實驗步驟由上海中醫藥大學附屬龍華醫院動物實驗倫理委員會批準，實驗操作遵循實驗動物飼養和使用指南。

1.2 試劑與藥物LB培養基預混粉末、LB肉湯瓊脂培養基預混粉末購于碧云天生物公司。DH-5α感受肽菌購于天根生化公司。質粒大量抽提試劑盒為Promega產品。質粒PT2/C-Luc/PGK-SB13、pT3-myr-AKT-HA、pT3-EF1aH N90-β-catenin、pT-3EF1a-Yap S127A均從Addgene公司獲得，其中PT2/C-Luc/PGK-SB13由John Ohlfest贈予(Addgene plasmid #20207；http://n2t.net/addgene:20207；RRID：Addgene_20207)[7]，pT3-myr-AKT-HA由Xin Chen贈予(Addgene plasmid #31789；http://n2t.net/addgene:31789；RRID：Addgene_31789)[8]，pT3-EF1aH N90-β-catenin由Xin Chen贈予(Addgene plasmid # 86499；http://n2t.net/addgene:86499；RRID: Addgene_86499)[9]，pT-3EF1a-Yap S127A由Xin Chen贈予(Addgene plasmid#46049；http://n2t.net/addgene:46049；RRID: Addgene_46049)[10]。Akt、β-catenin、Yap、二抗(抗兔)抗體購于Cell Signaling公司。PVDF膜(0.22、0.45 μm)、ECL化學發光底物購于Millipore公司。RIPA裂解液、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液購于碧云天生物公司。10%丙烯酰胺購于BIO-RAD公司。麗春紅染色試劑購于康為世紀公司。蘇木精染色劑、中性樹膠購于上海億欣生物公司。

1.3 實驗方法

1.3.1質粒擴增抽提 將含有PT2/C-Luc/PGK-SB13、pT3-myr-AKT-HA、pT3-EF1aH N90-β-catenin、pT-3EF1a-Yap S127A質粒導入DH-5α感受態細胞進行擴增，在LB培養基上生長后挑選適合的菌落放到大腸桿菌培養液中，在震蕩培養箱培養繁殖，使用Promega質粒大提試劑盒抽提純化，檢測濃度備用。

1.3.2小鼠HTVi質粒造模 尾靜脈高壓注射方法參照文獻[11]所述，將質粒混合于2 mL PBS中配置成溶液，在10 s內通過尾靜脈注射的方式注射至小鼠體內。10只小鼠適應性飼養，隨機分為對照組(n=5)，模型組(n=5)。模型組尾靜脈快速注射含有15 μg PT-3EF1a-Yap S127A、15 μg pT3-EF1aH N90-β-catenin、15 μg pT3-myr-AKT-HA和5 μg PT2/C-Luc/PGK-SB13的質粒混合溶液2 mL，對照組給予等量PBS。8周后小鼠麻醉處死，取肝臟組織凍存或多聚甲醛固定備用。

1.3.3小鼠活動、體重、肝重與肝體比 觀察記錄小鼠活動情況，測量體重、肝重，計算肝體比。

1.3.4病理學檢查 觀察小鼠肝臟形態。肝組織用4%多聚甲醛固定，進行脫水和石蠟包埋、切片、HE染色，鏡下觀察小鼠肝組織病理學變化。

1.3.5Western blot法 肝組織用RIPA裂解液勻漿提取蛋白，以12 000 r/min離心后收集上清液。細胞裂解物在10%丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉移至PVDF膜上。用含5%脫脂牛奶的TBST溶液封閉1 h，分別孵育Akt、Yap、β-catenin抗體4 ℃過夜，將膜在TBST溶液洗滌3次后室溫孵育二抗，將膜洗滌3次并通過ECL發光底物曝光顯影，將PVDF膜上全蛋白以麗春紅染色作為上樣量參照。

2 結果

2.1 小鼠體重、肝重與肝體比變化實驗期間對照組小鼠活動度好，飲食正常，皮毛光亮；尾靜脈注射4周后，模型組小鼠出現活動度差，精神萎靡，活動減少，皮毛顏色發黃雜亂，并逐漸加重。1只模型組小鼠在實驗第55天死亡。與對照組小鼠比較，模型組小鼠體重下降，肝重和肝體比顯著增加(圖1)。

圖1 各組小鼠體重(A)、肝重(B)、肝體比(C)變化與對照組相比，*P<0.05

2.2 小鼠肝臟形態學變化對照組小鼠肝臟表面光滑，形態正常。模型組小鼠肝臟體積明顯增大，質地較硬，肝臟表面出現大量顆粒狀、結節樣改變(圖2)。

AB

鏡下觀察對照組肝小葉結構完整，輪廓清晰，肝細胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝小葉肝細胞分界清晰。模型組肝索排列紊亂，出現腫瘤結節，伴隨肝細胞脂肪變性，炎細胞浸潤(圖3)。

100×400×對照組模型組

2.3 Western blot法檢測小鼠肝組織中Akt、Yap、β-catenin蛋白表達水平實驗以麗春紅染色(ponceau S)總蛋白灰度作為上樣量參照，結果顯示，模型組與對照組相比，Akt、Yap、β-catenin蛋白表達均顯著上調(圖4)，提示轉染的促癌基因在模型小鼠體內成功過表達。

圖4 小鼠肝組織中Akt、β-catenin、Yap蛋白的表達：A.Western blot條帶：1、3、5為對照組；2、4、6為模型組；B.蛋白表達相對值，與對照組相比，*P<0.05

3 討論

目前幾種常見的肝癌動物模型包括：誘導型模型通過亞硝胺類、黃曲霉素B1等化學藥物誘導建立肝癌模型[12]，此類動物模型成功率高，但存在造模時間長達1年、造模病死率高等缺點。移植模型是將人源或動物源的肝癌細胞株或者腫瘤組織塊種植到動物體內，包括皮下移植瘤模型、原位移植瘤模型[13-14]，目前應用較廣。皮下瘤易于觀察但不能模擬臨床腫瘤生長的環境，原位種植瘤可一定程度反映腫瘤與微環境的作用及觀察轉移，但種植過程繁瑣、技術要求高，另外種植模型多采用免疫缺陷鼠，不適合設計免疫系統的研究。轉基因肝癌模型是通過基因工程的方法將特定的促癌基因導入/抑癌基因敲除，如建立肝炎病毒轉基因模型、轉化生長因子β激活激酶1基因敲除模型，能夠模擬臨床腫瘤發展的過程。但生殖細胞基因修飾的小鼠成本高、耗時長，需要較高專業水平，胚胎病死率高，且比較適用于特定基因對于腫瘤的影響，如要研究多個基因對肝癌的作用需要非常復雜的小鼠雜交完成[15-16]。

本組實驗應用的肝癌造模方法需要三種要素：HTVi促進質粒轉染、SB轉座子介導基因整合、兩側帶有反向重復序列及啟動子的癌基因質粒。

HTVi是將大體積的質粒DNA溶液通過尾靜脈快速注射到小鼠體內，高壓情況下肝內皮細胞窗孔增大、肝細胞膜產生孔隙，特定的質粒DNA就能夠通過孔隙進入肝細胞中[17]；也有研究認為大體積質粒DNA溶液經尾靜脈快速注射會使小鼠出現短暫心衰，溶液經下腔靜脈返流進入肝臟的同時血液在肝血竇中無法回流，質粒在肝臟中長時間停留最終被肝臟攝取[18]，10%～40%肝細胞可被轉染。該技術可造成暫時性肝損傷，一般在1周內恢復正常。轉染入細胞的DNA在8～24 h后開始迅速降解，SB轉座子可將目的基因通過剪切插入整合至宿主基因，從而可穩定表達癌基因。該技術可達到2%～10%肝細胞長期穩定表達癌基因，最終誘導肝癌生成。根據轉染癌基因的種類和個數不同，一般可在1周至數月形成肝癌。

Akt、β-catenin、Yap是肝癌發生、發展的重要相關信號通路的關鍵基因。Akt作為一種蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶，其磷酸化即活化形式能夠促進細胞增殖、遷移、分化、凋亡等過程[19]。在癌癥的發生、發展過程中，β-catenin活化入核能夠促進細胞的轉移和增殖的靶基因的轉錄表達[20]。近幾年研究發現Yap通過促進肝癌細胞增殖、侵襲和轉移等惡性作用，成為肝癌形成的一條重要傳導通路[21]。Akt、β-catenin、Yap三種基因能夠通過不同信號通路，互相影響、調控，促進肝癌的形成。

本組實驗采取尾靜脈高壓注射SB質粒及Akt/β-catenin/Yap質粒的方法進行肝癌造模。8周后病理檢查結果顯示，模型組肝臟增大出現腫瘤結節，表明模型組均形成肝癌。肝癌形成導致小鼠體重下降、精神和活動差，并導致實驗結束前有1只小鼠死亡。模型鼠肝組織Akt、β-catenin、Yap基因出現顯著高表達，提示這些癌基因導致肝細胞的癌變及增殖形成肝癌。既往有研究應用該技術通過轉染Akt需要28周形成肝癌，Akt/Yap聯合轉染約6周[22]，而Akt/β-catenin聯合轉染約需4周[23]。本組應用Akt/β-catenin/Yap三種促癌基因誘導，以保障模型成功率，在8周時觀察到肝癌已達嚴重程度并導致1只小鼠死亡，說明肝癌誘導成功的時間點較早，但具體時間需要后續動態觀察實驗再明確。國外多采用FVB/N小鼠運用該技術造模，但這種小鼠在國內飼養較少且價格較高，本組采用常規價廉的C57BL/6J小鼠，證實應用HTVi SB和癌基因質粒建立肝癌模型在C57BL/6J小鼠也較容易實現。

尾靜脈高壓注射質粒建立肝癌模型具有明顯的優勢：注射的特定癌基因相關質粒能夠在肝臟中高效表達，可占正常肝細胞的2%～10%；注射通常在6～8周齡的小鼠中進行，不會對小鼠的胚胎發育產生任何影響，相比于轉基因或基因敲除小鼠更加經濟，且可顯著減少實驗所需的小鼠數量；尾靜脈高壓注射能夠應用于不同遺傳背景的小鼠，尤其是可用于非免疫缺陷小鼠，能夠應用于信號通路、細胞表型及評估藥物反應性等多種研究[24]。這項技術也存在一定不足：通過水動力轉染成瘤的肝臟病變面積相對于一般人肝腫瘤來說太大，小鼠肝臟出現大量結節無法計數；大多數人肝癌組織有肝纖維化或肝硬化的背景，而水動力注射只是將特定的基因傳遞到正常肝臟中，缺少腫瘤進展的相關環境。若需要研究特定致癌基因在腫瘤進展中的作用，可考慮運用聯合造模的方式，如在應用四氯化碳或高脂高糖飲食誘導的基礎上進行質粒注射轉染[25]。

綜上所述，本實驗利用HTVi SB質粒及Akt/β-catenin/Yap癌基因質粒的方法成功建立了小鼠肝癌模型，該模型對于研究促癌/抑癌基因單獨或聯合在肝癌發生中的作用尤其適用，因適用于非免疫缺陷型動物所以可應用于免疫、炎癥等相關的肝癌發生、發展機制和治療研究，另外將來可進一步聯合其它動物造模方法研究基礎疾病誘導的肝癌模型，如脂肪肝/代謝-肝癌、肝硬化-肝癌等。該方法經濟便捷、病死率低、成功率高且發病機制與臨床疾病相符，是一種可供今后科研和臨床藥物研究使用的肝癌動物模型。