利用生物信息學分析方法識別子宮頸癌患者預后相關長鏈非編碼RNA

張 妍，李 娟，齊麗榮，何洪敏

子宮頸癌是女性常見的三大腫瘤之一。WHO提供的數據顯示全球范圍內每年可以確診的子宮頸癌病例達50萬，而中國是子宮頸癌高發國家，每年確診的子宮頸癌患者達13.5萬人，占全球確診人數的25%。近年來，年輕婦女子宮頸癌的發病率呈上升趨勢[1-2]。積極探索子宮頸癌發生、發展機制及篩選預后相關分子標志物對攻克子宮頸癌具有積極的意義。lncRNA是一類長度大于200 nt的非編碼RNA，廣泛存在于真核細胞，隨著高通量測序技術的發展，人們逐漸發現lncRNA在各種類型腫瘤的發生、發展過程中起重要作用，但lncRNA與子宮頸癌的相關性研究目前仍處于初始階段。本實驗主要基于腫瘤數據庫數據，利用生物信息學分析方法，識別子宮頸癌預后相關的lncRNA。

1 材料與方法

1.1 數據獲取及差異lncRNA的篩選子宮頸癌轉錄組測序數據和臨床數據矩陣文件從TCGA數據庫官網直接下載，測序數據類型為原始數據，數據下載后整理出具有完整臨床信息的306例子宮頸癌樣本及3例配對癌旁樣本信息，本實驗數據基于數據庫不需倫理委員會批準，使用R軟件中的limma包篩選差異的lncRNA。

1.2 生存分析首先利用R軟件進行Kaplan-Meier生存分析和單因素Cox分析，獲取具有統計學意義(P<0.05)的lncRNA，隨后將篩選出的預后相關基因進行多因素回歸分析，以風險值=∑(基因系數×基因表達量)構建風險模型，并分析模型的可靠性，最終確定出與子宮頸癌預后相關的lncRNA。

1.3 lncRNA靶基因的確定本實驗采用R軟件中的Cor函數通過共表達方式進行預后lncRNA靶基因的篩選。

1.4 lncRNA靶基因功能注釋和通路分析分別加載R軟件包“clusterProfiler”、“org.Hs.eg.db”、“enrichplot”和“ggplot2”進行對lncRNA靶基因的GO和KEGG富集分析，GO與KEGG富集結果以氣泡圖和列表形式呈現。

1.5 統計學分析所有統計分析均使用R(v.3.4.3)進行，初步篩選差異lncRNA條件為FDR<0.05且差異倍數變化>2(|logFC|>1)，生存相關的預后分析涉及統計學意義的均選擇P<0.05，在尋找子宮頸癌預后相關lncRNA靶基因過程中實驗選用的共表達Pearsson相關系數絕對值>0.4且P<0.05，最后在進行GO與KEGG統計學分析過程中FDR<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 子宮頸癌與癌旁組織差異lncRNA初步篩選對TCGA數據庫中306例子宮頸癌樣本和3例癌旁樣本進行差異分析，以foldchange(差異倍數)絕對值>2倍且FDR值<0.05為界限，初步篩選共發現差異lncRNA 292個，其中上調的lncRNA有179個，下調的lncRNA有113個(圖1)。

圖1 差異lncRNA火山圖：紅色表示上調的lncRNA,綠色表示下調的lncRNA

2.2 差異lncRNA預后相關分析分別對上述292個差異lncRNA進行Kaplan-Meier生存分析與單因素Cox分析，然后取兩者交集，最終篩選出8個顯著差異的lncRNA，結果詳見表1和圖2。

圖2 8個顯著差異lncRNA的Kaplan-Meier生存分析及其與單因素Cox分析交集韋恩圖：A～H.lncRNA的Kaplan-Meier生存分析結果；I.lncRNA的Kaplan-Meier生存分析與單因素Cox分析交集韋恩圖

表1 Kaplan-Meier與單因素Cox生存分析篩選出的8個顯著差異的lncRNA

2.3 構建7個lncRNA的多因素Cox模型對上述篩選的8個lncRNA進行多因素Cox分析，構建生存模型(圖3A)，模型可靠性采用繪制ROC曲線形式呈現(圖3B)。根據風險值將樣本分為高風險與低風險兩組，進行生存相關分析(圖3C)。

圖3 7個lncRNA構建的預后模型：A.7個lncRNA構建的預測模型以森林圖形式呈現，*P<0.05,**P<0.01；B.評估模型可靠性的ROC曲線圖；C.風險值相關預后生存分析

2.4 lncRNA靶基因功能注釋利用生物信息學分析方法首先篩選多因素Cox分析構建的基因模型中差異有顯著性的4個lncRNA，即LINC00908、LINC01305、CASC15和DLEU1的共表達靶基因，篩選條件為Pearsson相關系數絕對值>0.4，且P<0.05，最后篩選出符合條件的編碼基因1 187個，最后對共表達靶基因進行功能注釋，包括GO和KEGG，最顯著富集分析結果見圖4與表2(只包括GO分析中顯著的生物學過程部分，表3)。

圖4 lncRNA靶基因功能注釋圖：A.靶基因的GO分析結果；GO包括BP(生物學過程)、CC(細胞成分)和MF(分子功能)三部分，圖中顯示每部分最顯著的前10個分析；B.靶基因KEGG分析結果，紅色越紅表示顯著性強，藍色顯示結果相反，黑色圓表示基因集中富集到該功能或者通路上的基因的數目，數目越大，表示富集的基因數目越多

表2 lncRNA靶基因的生物學過程富集

表3 lncRNA靶基因的通路富集

3 討論

TCGA數據庫是目前全球范圍內最大的腫瘤公共數據庫，為當前腫瘤相關研究提供寶貴的數據資源[3]。作者首先根據基因轉錄水平數據對子宮頸癌與癌旁組織中的差異lncRNA進行篩選，然后對初步篩選出的全部差異lncRNA進行Kaplan-Meier生存分析和單因素Cox分析，選擇兩種分析結果差異均具有顯著性的lncRNA基因集，最后共篩選出8個與患者預后相關的lncRNA，分別為：DLEU1、LINC00908、LINC00702、LINC01337、CASC15、LINC00484、UNQ6494和LINC01305。隨后采用多因素Cox回歸分析法構建與患者預后相關的基因模型，結果顯示構建的多基因模型其C統計量為0.7，ROC曲線面積為0.714，根據構建模型的多基因riskscore(riskscore中位值為1.085 6)將樣本分為高風險組和低風險組，結果顯示差異有顯著性(P=2.834E-06)，說明作者構建的基于lncRNA分子預測模型具有較為良好的效能，可以實現對子宮頸癌患者預后狀況的有效預測。

對于模型中7個lncRNA在腫瘤研究領域尤其子宮頸癌相關的研究情況，LINC00702在腦膠質瘤中可以通過激活Wnt/β-catenin通路促進其進展[4]，在非小細胞肺癌中，LINC00702通過調節miR-510/pten軸抑制非小細胞肺癌的增殖和侵襲[5]，而其在子宮頸癌中研究還未涉及，模型構建結果提示其可能是子宮頸癌的一個促癌因子。LINC01305可以通過抑制TNXB介導的PI3K/Akt信號通路抑制子宮頸癌細胞上皮間充質轉移[6]。DLEU1作為促癌因子在卵巢癌、子宮內膜癌等多種腫瘤中均有參與[7-8]，在子宮頸癌中，研究發現DLEU1通過與miR-381相互作用促進子宮頸癌中HOXA13的表達，從而促進子宮頸癌的增殖和侵襲[9]。CASC15在腫瘤中研究也較多，在子宮頸癌中發現lncRNA CASC15與其腫瘤生長密切相關，是子宮頸癌預后較差的診斷因子[10]，這與本實驗結果一致。目前，LINC00908、LINC01337與LINC00484在腫瘤領域中的相關研究還未涉及，這為以后相關研究提供了新的分子靶標。

為實現對子宮頸癌預后相關lncRNA功能的解讀，通過對其共表達基因功能的注釋。靶基因的生物學功能注釋結果顯示，子宮頸癌預后相關的lncRNA生物學過程主要富集細胞膜黏附分子對細胞的黏附作用、膠原原纖維組織、角質化、內胚層細胞分化等幾個方面，這些生物學過程均參與了子宮頸癌的發生、發展過程。在通路方面，其富集的通路主要集中在胞外基質受體相互作用、焦點粘連、PI3K/Akt信通路號、蛋白消化與吸收、細胞黏附分子、鈣離子信號通路等腫瘤相關通路，鑒于本實驗基于生物信息學方法，深層次機制研究還要基于濕實驗進行驗證。

綜上所述，本實驗利用生物信息學的方法分析了TCGA數據庫中子宮頸癌測序數據，同時構建與子宮頸癌預后相關的7個lncRNA基因集模型，并對其功能進行注釋，該實驗豐富了和創新了子宮頸癌lncRNA研究內容，也為今后子宮頸癌非編碼RNA的研究提供新思路。