FoxM1促進ABCA8表達參與骨肉瘤對順鉑化療的耐藥性

陳 靜，魯康洋，李明鳳，尹 玉,2，曹立宇,3，蔡永萍,2

骨肉瘤是好發于青少年的原發性骨腫瘤，惡性程度高，尤其行新輔助化療耐藥的患者預后差[1-2]。因此，化療耐藥成為制約骨肉瘤治療效果的瓶頸，探索化療耐藥機制及尋找逆轉靶點是骨肉瘤患者治療的一大難題。近年研究發現叉頭蛋白轉錄因子1(Forkhead Box M1, FoxM1)在促進腫瘤的發生、發展及化療耐藥中扮演重要角色[3]。魯康洋等[4]報道FoxM1在耐藥骨肉瘤細胞中的表達明顯升高，臨床骨肉瘤組織中FoxM1表達高的患者生存率較低。Isakoff等[5]認為骨肉瘤對化療耐藥可能與多種因素有關，但其發生機制尚不清楚。三磷酸腺苷結合盒轉運體(ATP binding cassette, ABC)是一種細胞膜轉運蛋白，在多種腫瘤化療耐藥方面起重要作用[6]，ABCA8是ABC家族成員之一。有研究表明ABCA8的表達增高與腫瘤化療耐藥密切相關[7]。但FoxM1是否通過調控ABCA8參與骨肉瘤對化療耐藥，目前尚未見報道。本文著重探討FoxM1是否通過增強ABCA8的表達促進骨肉瘤細胞對順鉑化療的耐藥，期望為臨床逆轉骨肉瘤化療耐藥提供新思路和治療靶點。

1 材料與方法

1.1 試劑骨肉瘤細胞系MG63購自中科院上海細胞庫。FoxM1抗體(克隆號ab175798)、β-actin抗體購于Abcam公司，ABCA8抗體(克隆號24351-1-AP)購自Proteintech公司。Thiostrepton(CAS：1393-48-2)購自Sigma公司；qRT-RCR試劑盒和Lipofectamine 2 000購自Invitrogen公司；ABCA8-shRNAs PLKO載體購自Sigma-Aldrich。順鉑購自南京制藥公司。

1.2 細胞培養細胞在含10%滅活胎牛血清的DMEM培養液中培養，2～3天棄1次舊液，0.25%胰蛋白酶消化傳代繼續培養。課題組前期建立的順鉑耐藥細胞系MG63/R在含2 μg/mL順鉑培養液中穩定生長和傳代；前期建立的穩定過表達FoxM1及對照組細胞分別命名為MG63/LV-FoxM1和MG63/LV-NC。

1.3 shRNA敲低ABCA8瞬時慢病毒載體細胞shRNA靶序列構建到PLKO載體中，對構建的載體進行測序鑒定并轉染293T細胞，熒光顯微鏡下觀察轉染率。收集上述病毒上清，轉染細胞，經嘌呤毒素篩選建立ABCA8敲低細胞株。shRNA序列如下：ABCA8-sh1：5′-CCGGCATGGGTCATAGTATCTGATA CTCGAGTATCAGATACTATGACCCATGTTTTTTG-3′；ABCA8-sh2：5′-CCGGCCAAATTCTGTGTTCCTGTTTC TCGAGAAACAGGAACACAGAATTTGGTTTTTTG-3′；NTC：5′-CCGGCAACAAGATGAAGAGCACCAACTCG AGTTGGTGCTCTTCATCTTGTTGTTTTT-3′。

1.4 qRT-PCR采用Trizol試劑提取總RNA。通過分光光度法測定RNA的純度和濃度。逆轉錄PCR，具體操作步驟參考試劑盒說明書進行。FoxM1引物序列：上游5′-TGCAGCTAGGGATGTGAATCTT C-3′，下游5′-GGAGCCCAGTCCATCAGAACT-3′；ABCA8引物序列：上游5′-TGAAATGGAGCCGATCCT TC-3′，下游5′-AGTATTGCAGTGATTTGGCCTT-3′；18S引物序列：上游5′-CGGCGACGACCCATTCGA AC-3′，下游5′-GAATCGAACCCTGATTCCCCGTC-3′。本組以18S rRNA為內參。

1.5 Western blot法收集細胞后加入裂解液，提取總蛋白，采用BCA法進行蛋白定量，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜后5%脫脂牛奶封閉1 h以上，再加入一抗FoxM1(1 ∶1 000稀釋)、ABCA8(1 ∶1 000稀釋)或β-actin(1 ∶1 000稀釋)4 ℃孵育過夜，加入HRP標記的兔二抗(1 ∶10 000稀釋)室溫孵育2 h，顯影。

1.6 染色質免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation, ChIP)直徑10 cm平皿培養的骨肉瘤耐藥細胞MG63/R中加入1%甲醛，37 ℃交聯固定DNA與蛋白質10 mim。用冷PBS洗滌細胞，并用細胞裂解法收集細胞，超聲處理10 min后，離心取上清。4 ℃孵育3 h，加入IgG beads，旋轉儀4 ℃過夜。對復合物清洗，純化的DNA片段通過qRT-PCR分析。加入FoxM1抗體為實驗組，不加抗體為陰性對照(CTR)。具體步驟參考EZ-ChIP試劑盒(Millipore)。運用生物信息學法在Ensemble：http://www.ensembl.org/indexhtml網站查找ABCA8基因上游2 000 bp的啟動子區域。用Jaspar http://jaspar.genereg.net/預測FoxM1在ABCA8基因上游啟動子區域(forkhead response elements, FHRE)的結合位點。引物序列叉頭反應元件如下：5′-AGA TCTTTTCTTCTAGGGGTCTGAC-3′和5′-GAGGAGTA AGAGGCTCAACATGGT-3′；5′-TTTCACAGCGGCTGC ACTAA-3′和5′-AGCAGCATGAGAGCAGACTAATA CA-3′。

1.7 細胞增殖實驗將處于對數生長期的骨肉瘤貼壁細胞以每毫升2×104個細胞分別接種于96孔板，培養24 h后棄去培養液，分別加入DMSO、聯合使用4 μmol/L Thiostrepton或單獨使用2 μg/mL順鉑。第1～5天，每孔中加入新鮮配置的MTT溶液，37 ℃保存4 h后棄去液體，每孔加入150 μL DMSO，紫色結晶溶解，室溫搖床搖10 min，490 nm處測定吸光度。

2 結果

2.1 骨肉瘤耐藥細胞中FoxM1和ABCA8的表達課題組前期已獲得的骨肉瘤親本細胞和耐藥細胞中分別采用qRT-PCR法和Western blot法檢測FoxM1和ABCA8 mRNA和蛋白的表達。qRT-PCR法檢測結果顯示：骨肉瘤耐藥細胞中FoxM1和ABCA8的mRNA表達比親本細胞明顯升高(圖1A)。Western blot檢測結果顯示：耐藥細胞MG63/R的蛋白表達高于親本細胞MG63，以上數據表明FoxM1和ABCA8蛋白表達在耐藥細胞中比親本細胞明顯增高(圖1B)。

圖1 A.qRT-RCP法檢測MG63/R和MG63細胞中FoxM1和ABCA8 mRNA的表達，*P<0.05；B.Western blot法檢測MG63/R和MG63細胞中FoxM1和ABCA8蛋白的表達

2.2 FoxM1與ABCA8的相關性qRT-PCR結果顯示，過表達FoxM1 MG63/LV-FoxM1中FoxM1與ABCA8的mRNA表達水平與對照組相比，其表達量明顯升高(圖2A)。Western blot檢測顯示，與對照組MG63/LV-NC相比，MG63/LV-FoxM1的FoxM1與ABCA8蛋白表達明顯升高(圖2B)。

圖2 A.qRT-PCR法檢測FoxM1過表達MG63/LV-FoxM1及對照組MG63/LV-NC中FoxM1及ABCA8 mRNA的表達，*P<0.05；B.Western blot法檢測MG63/LV-FoxM1和MG63/LV-NC細胞中FoxM1及ABCA8蛋白的表達

2.3 FoxM1抑制劑Thiostrepton與ABCA8表達的關系在耐藥細胞MG63/R中加入4 μmol/L Thiostrepton，處理24 h后檢測FoxM1及ABCA8的mRNA表達，48 h后檢測其蛋白表達。qRT-PCR結果顯示，4 μmol/L Thiostrepton處理后的骨肉瘤耐藥細胞FoxM1及ABCA8 mRNA表達明顯下降(圖3A)。Western blot結果顯示，4 μmol/L Thiostrepton處理組與DMSO組FoxM1與ABCA8蛋白表達相比，其表達量明顯下降(圖3B)。

圖3 A.qRT-PCR檢測FoxM1及ABCA8 mRNA的表達，*P<0.05；B.Western blot法檢測ABCA8及FoxM1蛋白的表達

2.4 抑制FoxM1或ABCA8對骨肉瘤細胞順鉑化療的影響在骨肉瘤耐藥細胞MG63/R和FoxM1過表達細胞株MG63/LV-FoxM1中分別加入2 μg/mL順鉑+DMSO或2 μg/mL順鉑+4 μmol/L Thiostrepton，結果顯示：與DMSO組相比，Thiostrepton處理后，細胞增殖能力明顯降低(圖4A、B)。在MG63/R和MG63/LV-FoxM1中分別用shRNA敲低ABCA8，結果顯示，同NTC組相比，ABCA8 shRNA敲低組骨肉瘤細胞的增殖能力亦明顯降低(圖4C、D)。

圖4 細胞增殖實驗顯示，MG63/R(A)和MG63/LV-FoxM1(B)中分別給予2 μg/mL順鉑+DMSO或2 μg/mL順鉑+4 μmol/L Thiostrepton，與DMSO組相比，聯合Thiostrepton處理后，細胞增殖能力明顯降低；在MG63/R(C)和MG63/LV-FoxM1(D)中分別給予2 μg/mL順鉑或shRNA敲低ABCA8，與NTC組相比，骨肉瘤細胞的增殖能力亦明顯降低

2.5 ChIP實驗檢測FoxM1與ABCA8啟動子結合運用生物信息學預測ABCA8基因上游啟動子區域FHRE位點是-1 383～-1 373區域，具體作用序列是TCTTTTTTATA(圖5A)。ChIP結果顯示：與對照組相比，FoxM1在ABCA8啟動子區域富集(圖5B)。以上實驗結果表明FoxM1可能與ABCA8啟動子區域結合并促進ABCA8轉錄。

圖5 A.運用生物信息學預測ABCA8基因上游啟動子區域FHRE位點；B.與CTR相比，FoxM1在ABCA8啟動子區域FHRE富集，表明FoxM1可能與ABCA8啟動子區域直接結合促進ABCA8轉錄

3 討論

骨肉瘤是一種間葉組織來源常見的骨原發性高度惡性腫瘤，好發于青少年。目前，骨肉瘤治療采用術前新輔助化療和手術切除及術后輔助化療的綜合治療,標準化療方案包括甲氨喋呤、阿霉素和順鉑[1]。然而患者的生存率并未得到有效提高，新輔助化療耐藥的患者易出現復發和遠處轉移，治療困難，即使聯合其它藥物治療也未能明顯改善患者預后[8]。因此，探索化療耐藥機制成為骨肉瘤亟需解決的難題。

研究認為骨肉瘤對化療耐藥可能與多種因素有關[2,5]，如ABC轉運體表達增高促進藥物外排能力增強、谷胱甘肽/谷胱甘肽S轉移酶改變藥物代謝對化療藥物的滅活、DNA拓撲異構酶改變導致抗腫瘤靶點改變等。目前，骨肉瘤化療耐藥的發生機制仍不清楚。近年研究發現FoxM1廣泛表達于多種腫瘤組織中，且與腫瘤的發生發展、血管形成、轉移和化療耐藥密切相關[3,9]。我們前期實驗也做了一些相關分析，如發現骨肉瘤細胞中FoxM1通過上調DNA損傷修復蛋白Rad50和Rad51表達，促進骨肉瘤細胞的化療耐藥[4,10]。但FoxM1促進化療耐藥的分子機制仍然未知，尤其FoxM1與ABC轉運體在骨肉瘤化療耐藥中的相關報道非常有限。

ABC轉運體屬于細胞膜轉運蛋白，通過細胞膜泵藥物外排或促進腫瘤干細胞表達參與化療耐藥[6,11-12]。ABC轉運體家族蛋白表達增高與骨肉瘤化療耐藥相關，患者預后更差[13]。近年研究顯示FoxM1可能調控ABC轉運體，如在結直腸癌中FoxM1上調ABCC10參與對5-氟脲嘧啶的耐藥[14]。ABCA8是ABC轉運蛋白家族的成員之一[15]，在卵巢癌中ABCA8的表達增高與化療耐藥及預后差密切相關[7,16]。但FoxM1是否調控ABCA8，目前尚未見報道。本組發現在耐藥細胞MG63/R中FoxM1和ABCA8的表達均比親本細胞MG63明顯升高，抑制FoxM1后ABCA8的mRNA和蛋白表達量也明顯下降，而過表達FoxM1后ABCA8的表達也同時上升。此外，聯合使用FoxM1抑制劑或降低ABCA8的表達可增強骨肉瘤細胞對順鉑的敏感性。因此，作者推測FoxM1可能通過調控ABCA8參與骨肉瘤細胞對順鉑的耐藥性。研究發現FoxM1通過影響細胞凋亡參與化療耐藥[3]，本組將在后續實驗中進一步采用流式細胞術等方法探討FoxM1及ABCA8是否影響細胞凋亡。

本組為了分析FoxM1和ABCA8的具體作用機制，進行了ChIP檢測。ChIP是一種研究蛋白質與DNA直接相互作用的方法，并被廣泛應用于轉錄因子與靶基因啟動子區特異核苷酸序列結合方面的研究[17]。本組通過生物信息學法預測和ChIP技術發現FoxM1在ABCA8啟動子中的結合位點是-1 383至-1 373區域中的FHRE區域富集，具體作用序列是TCTTTTTTATA，表明FoxM1可能通過與啟動子區域結合促進ABCA8轉錄，但后續可能需要雙熒光素酶報告基因法進一步驗證FoxM1正向調控ABCA8的表達。實驗推測FoxM1可能通過調控ABCA8參與骨肉瘤細胞化療耐藥，還需積累更多的體內外實驗，進一步驗證聯合FoxM1抑制劑或抑制ABCA8是否增加順鉑化療藥物的敏感性。此外，也有研究報道通過ChIP技術發現FoxM1與ABCC5啟動子區域結合，促進其轉錄參與鼻咽癌細胞對紫杉醇化療耐藥[18]。

腫瘤細胞對化療的耐藥性是導致骨肉瘤患者化療失敗的重要原因，分析化療耐藥機制及尋找逆轉靶點是現階段骨肉瘤治療的難題。本組發現FoxM1可能通過調控ABCA8參與骨肉瘤對順鉑的耐藥，抑制FoxM1或ABCA8的表達可能成為臨床逆轉骨肉瘤對順鉑化療耐藥的新靶點。