海南地區結直腸癌中錯配修復蛋白及多藥耐藥蛋白的表達及意義

謝仲鵬，李海榮，吳余，何艾樺，肖 歸，李新年

結直腸癌是全球發病率位居第三、病死率位居第二的惡性腫瘤[1]。結直腸癌的發生、發展過程復雜，包括染色體不穩定(chromosomal instability, CIN)和微衛星不穩定(microsatellite instability, MSI)等途徑[2]，當MMR蛋白(MSH2、MSH6、MLH1、PMS2)缺失時可引起MSI，與腫瘤的發生、發展密切相關[3]。多藥耐藥(multidrug resistance, MDR)蛋白中的P-gp、GSTπ、TopoⅡ可通過不同的機制降低化療藥物的療效，是導致化療失敗的原因之一[4]。本實驗檢測海南地區707例結直腸癌標本中MMR蛋白及MDR蛋白的表達特點，分析MMR蛋白及MDR蛋白與臨床病理特征的關系，為結直腸癌患者的治療及預后判斷提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料收集海南省人民醫院2017年1月～2019年6月診治的結直腸癌患者707例，其中男性441例，女性266例；年齡25～93歲，平均(61.6±12.6)歲。所有病例臨床病理資料均完整，患者術前均未接受化療或靶向治療。

1.2 方法標本均經10%中性福爾馬林固定，常規制片，HE染色，鏡下觀察。免疫組化染色采用EnVision兩步法，一抗包括MSH2、MSH6、MLH1、PMS2、P-gp、GSTπ、TopoⅡ，所有試劑均購自福州邁新公司。

1.3 結果判定MMR蛋白在腫瘤細胞核表達即判定為陽性，與核染色強弱及細胞多少無關，全部腫瘤細胞核不著色為陰性；任一MMR蛋白表達缺失為錯配修復基因缺陷(mismatch repair deficent, dMMR)，MMR蛋白全部陽性為錯配修復基因完整(mismatch repair proficient,pMMR)。P-gp陽性定位于細胞膜/細胞質，GSTπ陽性定位于細胞質，TopoⅡ陽性定位于細胞核。P-gp、GSTπ陽性細胞數≤10%為(-)，11%～25%為(+)，26%～75%為()，≥76%為()；TopoⅡ陽性細胞數≤25%為Ⅰ級，26%～50%為Ⅱ級，51%～75%為Ⅲ級，≥76%為Ⅳ級。

2 結果

2.1 結直腸癌中MMR蛋白的表達免疫組化結果顯示，MMR蛋白陽性定位于細胞核(圖1)，707例結直腸癌中，dMMR 55例(7.8%，55/707)、pMMR 652例(92.2%，652/707)，其中MSH2、MSH6、MLH1、PMS2蛋白表達缺失率分別為2.3%(16/707)、2.4%(17/707)、4.5%(32/707)、5.2%(37/707)；4種蛋白共同缺失者1例(0.1%，1/707)，MSH2與MSH6共同缺失16例(2.3%，16/707)，MLH1與PMS2共同缺失32例(4.5%，32/707)，MSH6單獨缺失1例(0.1%，1/707)，PMS2單獨缺失5例(0.7%，5/707)。Spearman相關性分析表明，MSH2與MSH6表達呈正相關(rs=0.969，P<0.001，表1)，MLH1與PMS2表達呈正相關(rs=0.927，P<0.001，表2)。

圖1 腫瘤細胞MSH2(+)，定位于細胞核，EnVision兩步法 圖2 腫瘤細胞P-gp()，定位于細胞膜及細胞質，EnVision兩步法 圖3 腫瘤細胞GSTπ()，定位于細胞質，EnVision兩步法 圖4 腫瘤細胞TopoⅡ Ⅳ級，定位于細胞核，EnVision兩步法

表1 結直腸癌中MSH2蛋白與MSH6蛋白表達的相關性

表2 結直腸癌中MLH1蛋白與PMS2蛋白表達的相關性

2.2 結直腸癌中MDR蛋白與MMR蛋白表達的關系免疫組化結果顯示，P-gp(圖2)、GSTπ(圖3)及TopoⅡ(圖4)表達分別位于細胞膜/細胞質、細胞質及細胞核。P-gp(-～)分別占2.4%(17/707)、3.8%(27/707)、47.4%(335/707)、46.4%(328/707)；GSTπ(-～)分別占21.5%(152/707)、11%(78/707)、30.6%(216/707)、36.9%(261/707)；TopoⅡ Ⅰ～Ⅳ級分別占9.4%(66/707)、45.5%(322/707)、40.3%(285/707)、4.8%(34/707)。Spearman相關性分析表明，MSH2、MSH6、MLH1、PMS2表達與P-gp、GSTπ、TopoⅡ表達無明顯相關性(P>0.05，表3)。

表3 結直腸癌中MMR蛋白與MDR蛋白表達的相關性

2.3 結直腸癌中MMR狀態與臨床病理特征的關系dMMR組與pMMR組相比，與患者發病年齡、發病部位、腫瘤大小、分化程度、組織類型、神經侵犯、淋巴結轉移等有關(P<0.05)。表現為dMMR組患者發病年齡較早，常發生于右半結腸，腫瘤較大，分化程度低，黏液腺癌多見，較少出現神經侵犯及淋巴結轉移。而與患者性別、浸潤深度、脈管侵犯等無關(P>0.05，表4)。

2.4 結直腸癌中MDR蛋白表達與臨床病理特征的關系本實驗以P-gp、GSTπ(-)及(+)為低表達，()及()為高表達；以TopoⅡ Ⅰ級為低表達，Ⅱ～Ⅳ級為高表達。P-gp蛋白表達與組織類型、淋巴結轉移等有關(P<0.05)，表現為管狀腺癌及淋巴結轉移患者較高表達P-gp。GSTπ蛋白表達與分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移等有關(P<0.05)，表現為低分化、浸潤較深、有淋巴結轉移者較高表達GSTπ。TopoⅡ蛋白表達與發病部位、分化程度等有關(P<0.05)，表現為左半結腸及中低分化患者較高表達TopoⅡ(表4)。

表4 結直腸癌中MMR狀態及MDR蛋白表達與臨床病理特征的關系

3 討論

隨著人們生活水平的提高，結直腸癌的發病率呈逐年增高趨勢，結直腸癌的分子特征與臨床病理特征、治療及預后密切相關，因此全面認識結直腸癌的分子特征尤為重要。

MSI是結直腸癌發生、發展的重要因素之一，對于MSI的重復序列拷貝數檢測常用的方法為PCR檢測，利用5對引物檢測核苷酸重復序列，多于2個位點突變則為高頻MSI(MSI-H)，1個位點突變為低頻MSI(MSI-L)，無突變則為微衛星灶穩定(microsatellite stoves are stable, MSS)[5]。但PCR技術成本較高，不便于臨床常規開展，運用免疫組化法檢測MMR蛋白也可以判斷MSI的狀態，dMMR即MSI-H，pMMR即MSI-L/MSS，MMR與MSI一致率>90%[6]。免疫組化法成本低、耗時少，適用于臨床一線篩查。

本實驗運用免疫組化法對MMR蛋白進行檢測，在707例結直腸癌患者中，dMMR有55例(7.8%)，低于Cheah等[7]報道的9.9%，高于Hu等[8]報道的6.7%。Samowitz等[9]的實驗結果顯示，MSH2與MSH6的表達呈正相關，MLH1與PMS2的表達呈正相關，因為PMS2只有和MLH1形成復合物才能保持穩定，MLH1缺陷會導致PMS2的繼發性缺失；MSH6只有和MSH2形成復合物才能保持穩定，MSH2缺陷會導致MSH6的繼發性缺失。dMMR組結直腸癌患者的平均年齡為(54.8±14.9)歲，與文獻報道[(56.0±14.6)歲]基本一致。趙喜連等[10-11]分析結果顯示，dMMR組患者發病年齡較早、常發生于右半結腸、腫瘤較大、分化程度低、黏液腺癌多見、較少出現神經侵犯及淋巴結轉移，與其它報道較一致。

目前結直腸癌的治療方式為手術切除聯合化療，dMMR患者無法從常規的化療藥物5-氟尿嘧啶中獲益，但可以應用抗PD-1/PD-L1單抗或聯合抗CTLA-4單抗的免疫治療方式[12]。另一個導致化療失敗的原因是腫瘤細胞高表達MDR蛋白，P-gp可將腫瘤細胞內的化療藥物泵出細胞外，GSTπ可降解腫瘤細胞中的化療藥物，TopoⅡ參與基因重組、轉錄和DNA修復，與MDR關系密切[4]。本實驗結果顯示，管狀腺癌及淋巴結轉移者較高表達P-gp，中低分化、浸潤較深、有淋巴結轉移者較高表達GSTπ，左半結腸及中低分化患者較高表達TopoⅡ。Liu等[13]研究結果表明，結直腸癌中P-gp表達與腫瘤浸潤深度呈正相關，TopoⅡ表達與淋巴結轉移和腫瘤浸潤深度呈正相關。而Yu等[14]在胃腺癌中的研究結果表明，GSTπ在男性及高分化者中較高表達，TopoⅡ在高分化者中較高表達，此種差異可能與地域及發病部位不同有關。

綜上所述，本實驗通過免疫組化法檢測結直腸癌中MMR蛋白及MDR蛋白表達情況，發現MMR蛋白及MDR蛋白表達與臨床病理特征存在一定關系，對結直腸癌患者的治療及預后均有重要意義。