TOPⅡ、IDH1表達與膠質瘤預后的相關性及臨床價值

陳 洋，陰魯鑫，李琳琳，王天男，劉宇昊，高文昌

膠質瘤是源自神經上皮最常見的腦惡性腫瘤，占原發性成人腦腫瘤的70%。膠質瘤易復發且具有浸潤性，預后不良[1]。高級別膠質瘤最具侵襲性，近50%的患者在1～2年內死亡。由于膠質瘤多呈浸潤性生長，手術徹底切除難度大，復發率高，且化療副作用大，因此基因治療和靶向藥物治療成為當今全球研究膠質瘤的熱點。研究表明，拓撲異構酶Ⅱ(topoisomerase Ⅱ, TOPⅡ)的表達與腦膠質瘤的惡性程度有關，可能影響患者的預后[2-3]。異檸檬酸脫氫酶1(isocitrate dehydrogenase 1, IDH1)作為膠質瘤預后的主要分子標記，可能提示較好的預后[4]。本文回顧性分析89例膠質瘤標本，探究TOPⅡ、IDH1與膠質瘤惡性程度及其預后的關系。

1 材料與方法

1.1 材料收集2014年1月～2017年10月徐州醫科大學附屬醫院神經外科行手術切除并經病理檢查確診的膠質瘤標本89例，其中男性48例，女性41例，年齡23～74歲，平均50.6歲。包含高級別膠質瘤56例，其中間變性星形細胞瘤(Ⅲ級)18例，膠質母細胞瘤(IV級)38例；低級別膠質瘤33例，其中少突膠質細胞瘤(Ⅱ級)8例，星形細胞瘤(Ⅱ級)25例。

1.2 隨訪對患者本人或家屬進行電話隨訪，隨訪時間自患者手術日開始，截至2019年12月，每隔數月定期隨訪，隨訪內容包括患者術后是否放化療、是否死亡及死亡具體時間，直至隨訪結束，期間失訪8例，失訪人員不納入統計范圍。

1.3 試劑即用型鼠抗人TOPⅡ單克隆抗體和IDH1 R132H鼠抗人單克隆抗體均購自北京中杉金橋公司，DAB顯色劑、EDTA(pH 8.4)修復液、PBS緩沖液、二抗均購自羅氏(上海)公司。

1.4 方法標本均經10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm厚連續切片，分別行HE及免疫組化EnVision法染色，染色步驟嚴格按試劑盒說明書進行，DAB顯色，蘇木精復染，返藍；乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，PBS代替一抗作為陰性對照。

1.5 判斷標準結果由兩位有經驗的病理醫師閱片后，取得一致意見，以腫瘤周圍正常腦組織作為內對照。免疫組化染色結果以細胞膜、質、核中分別存在粗細一致的棕黃色顆粒為陽性。IDH1為胞質陽性，光鏡下隨機觀察數個高倍視野，記錄高倍視野中陽性細胞的百分率，采用染色判定標準：腫瘤細胞數≥5%即IDH1陽性(IDH1突變型)。細胞核陽性為TOPⅡ陽性，每張切片計數所有TOPⅡ陽性細胞數/腫瘤細胞總數，為TOPⅡ的百分比，陽性腫瘤細胞數≥5%為陽性。

1.6 統計學方法采用SPSS 16.0軟件進行統計數據分析，TOPⅡ、IDH1表達與膠質瘤惡性程度的關系用χ2檢驗分析，TOPⅡ、IDH1在膠質瘤中的表達采用Spearman等級相關分析法，臨床因素與生存時間的關系用Kaplan-Meier生存曲線表示，再用Log-rank法分析，多因素采用Cox回歸分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TOPⅡ、IDH1表達與膠質瘤惡性程度的關系TOPⅡ、IDH1表達與膠質瘤病理級別有關。TOPⅡ在低級別膠質瘤中的陽性率為26.7%，在高級別膠質瘤中的陽性率為90.2%(圖1A)；IDH1在低級別膠質瘤中的陽性率為63.3%(圖1B)，在高級別膠質瘤中的陽性率為9.8%(表1)。

表1 不同級別膠質瘤組織中TOPⅡ和IDH1的表達

圖1 A.膠質瘤組織中TOPⅡ陽性，EnVision法；B.膠質瘤組織中IDH1陽性，EnVision法

采用等級相關分析TOPⅡ與IDH1表達之間的關系(表2)，Spearman等級相關分析結果顯示，TOPⅡ與IDH1在膠質瘤中的表達呈負相關(r=-0.459，P<0.001)。

表2 膠質瘤組織中TOPⅡ與IDH1表達的相關性

2.2 膠質瘤患者預后的影響因素各因素與生存時間的關系采用生存曲線表示(圖2)，用Log-rank檢驗計算中位生存期和1年生存率，根據臨床病理因素分組(表3)，結果顯示，患者年齡、病理級別、術前KPS評分、術后放化療、TOPⅡ表達和IDH1表達與患者預后有關，與患者性別無關。IDH1陽性患者生存期較長，TOPⅡ陽性患者預后較差，病理級別低、術前KPS評分高、術后放化療的年輕患者預后相對較好。

2.3 膠質瘤患者預后的單因素分析變量篩選方法：逐一對自變量進行Log-rank檢驗，計算P值，將P<0.05的變量納入多因素Cox回歸分析(表3，圖2)，患者年齡、術前KPS評分、病理級別、術后放化療、TOPⅡ和IDH1表達滿足變量篩選。

圖2 Kaplan-Meier生存曲線:A.病理級別與預后的關系；B.術后放化療與預后的關系；C.TOPⅡ表達與預后的關系；D.IDH1表達與預后的關系

表3 各臨床病理特征與膠質瘤患者預后的關系

2.4 影響膠質瘤患者術后預后的多因素回歸分析將單因素分析中有意義的臨床要素選入多因素分析，以P=0.05水平進行篩查，IDH1陽性、病理級別和術后放化療嚴重影響膠質瘤的預后，病理級別分型是膠質瘤預后的危險因素，IDH1陽性、術后放化療是膠質瘤預后的保護因素(表4)。病理級別高的膠質瘤患者死亡風險是病理級別低患者的5.231倍，而術后放化療患者的死亡危險是術后無放化療患者的0.205倍，IDH1陽性患者的死亡風險是IDH1陰性患者的0.388倍。

表4 臨床影響因素與患者預后的Cox回歸分析

3 討論

腦膠質瘤的發生、發展是多因素共同參與的復雜過程，其中包含多個細胞因子及癌癥基因的共同作用。由于這些細胞因子和癌癥基因的異常表達而使腫瘤增殖潛能和疾病預后相應發生變化。因此，探究影響膠質瘤的臨床病理因素對早期判斷疾病預后和精準治療有重要的指導意義。因此，本實驗通過對膠質瘤患者術后的臨床病理資料進行回顧性分析，以探討TOPⅡ、IDH1在腦膠質瘤中的表達特點及與預后的關系。

DNA TOP是經過催化DNA鏈的斷裂和聯合從而控制DNA拓撲狀態的一類酶。其位于細胞核內，主要分為TOPI和TOPⅡ，其中TOPⅡ屬于同型二聚體蛋白質。其是DNA復制、轉錄和染色體分離所必需的，與細胞增殖有關，也是抗癌藥物的關鍵靶點[5]。其中TOPⅡa通過各種方式在腫瘤的發展中起重要作用。有研究表明，TOPⅡa產物存在于腫瘤組織中，這些產物可以刺激和促進腫瘤生長、轉移和免疫抑制，同時抑制細胞凋亡并導致對化療的抵抗[6]。這與本組實驗得出TOPⅡ陽性患者預后較差的結論一致。TOPⅡa與活躍的細胞增殖有關，同時也是多種化療藥物的分子靶點，其表達水平是影響化療敏感性的重要因素[7]。臨床上應用TOPⅡ靶向藥物正是通過干擾DNA和TOPⅡ的結合或增加DNA-TOP共價復合物的濃度來實現的。在常見的細胞毒性藥物中，蒽環類藥物如阿霉素和依托泊苷是通過結合DNA-TOPⅡa復合物并抑制DNA的再連接起作用的。其能有效干擾TOPⅡ重新連接斷裂的DNA雙鏈，破壞其3級結構，從而阻礙DNA復制、轉錄和RNA合成過程，進而抑制腫瘤細胞生長[8]。霍海波[9]的研究亦發現TOPⅡa高表達，提示體內腫瘤組織增殖活性高，也表明化療藥物對膠質瘤患者較為敏感，化療效果較好。綜合顯示，TOPⅡ靶向藥物對TOPⅡ高表達患者可能更有效地提高生存期限，延緩生命，同時TOPⅡ基因檢測對膠質瘤患者預后預測和臨床化療藥物的選擇提供有效指導。

IDH是檸檬酸循環的關鍵酶，在維持機體正常代謝的過程中起到至關重要的作用。近年來在膠質瘤、甲狀腺癌、急性髓細胞性白血病等諸多惡性腫瘤中均發現了IDH1和IDH2突變。研究表明IDH1突變作為膠質瘤的生物標志物，可能提示更好的預后[10]。本組實驗結果亦顯示，IDH1陽性患者中位生存期比陰性患者顯著延長，IDH1陽性患者的死亡風險是IDH1陰性患者的0.350倍。這可能與IDH1突變型腫瘤的低增殖率有關。研究表明[11]，IDH1突變能改變機體代謝和細胞結構，其中糖酵解和脂質代謝發生了很多改變，尤其是長鏈脂酰COA合成酶1(ACSL1)的表達水平較低。癌癥基因組圖譜提示ACSL1水平越低，IDH1突變膠質瘤患者預后越好[12]。另外，癌癥相關的慢性炎癥會引發不受控制的血小板活化，導致腫瘤生長、血管生成、轉移和癌癥相關血栓形成[13]。腫瘤浸潤性中性粒細胞增多、外周血中性粒細胞增多和中性粒細胞淋巴細胞比率升高也會導致預后不良[14]。而IDH1突變型膠質瘤通過下調低氧誘導因子(hypoxia inducible factor, HIF)的表達，炎癥水平普遍較低，小血管生成和活化細胞數目減少，生存期往往延長[15]?？傊?，TOPⅡ和IDH1的表達水平反映了膠質瘤轉歸的趨勢，可以作為判斷膠質瘤預后的指標。

影響膠質瘤患者預后的因素較多，本組實驗結果表明，術后放化療和病理級別也是膠質瘤患者預后的影響因素。在腫瘤類型確定的情況下，腫瘤的病理級別越低，異型性就越小，腫瘤的侵襲性和進展性潛能越低，通常療效反饋越好，相應預后越好。膠質瘤患者術后放化療可加速術后恢復，延緩病情進展，減少早期腫瘤轉移和減緩后期加速進展，從而促進患者康復和延緩生命。這與文中討論膠質瘤病理級別高的患者死亡風險是病理級別低患者的5.231倍和術后放化療患者的死亡危險是術后無放化療患者的0.205倍的結果相符。

綜上所述，TOPⅡ和IDH1與膠質瘤病理級別有關，TOPⅡ陽性患者生存期短，IDH1陽性提示預后良好，因此，聯合檢測TOPⅡ和IDH1有利于判斷膠質瘤惡性程度及預測患者生存期，進而為膠質瘤的診斷、預后判定和個性化治療提供有效的理論依據。