HE切片褪色后進行免疫熒光染色的方法探討

高洪彬，梁 十，郭揚清，吳玉娥，賈歡歡，劉 嬋，王希龍，陳梅麗

免疫熒光檢測技術具有專一性強、靈敏度高、實用性好等優點[1]，為病理檢測中一項重要的輔助技術。HE染色是常規的病理學檢測方法，有時HE染色下病變的確診或進一步研究需要進行免疫熒光染色輔助，此時往往會選擇重切蠟塊，但重切的切片與HE觀察不是同一張組織片、需要觀察的位置或多或少的發生了改變，不利于與原HE切片進行精準的比較分析，更甚者有些組織塊小、重切片未能切出組織切片進行免疫熒光染色。因此，探討一種HE切片褪色后進行免疫熒光染色的方法具有重要的應用價值。本實驗通過實踐，摸索了一些簡便有效的HE切片染色褪色后進行免疫熒光染色的方法并進行比較分析，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及實驗環境(普通級)食物蟹猴3只，由廣東春盛生物公司提供[SCXK(粵)2014-0027]，所有涉及實驗動物的實驗方案經動物關懷與使用倫理委員會批準。動物飼養場所按照國際實驗動物評估和認證管理委員會的規定和要求，對動物進行日常的飼養關懷和管理。

1.2 儀器與試劑采用的儀器包括Leica TP1020自動脫水機，Leica EG1150H+C石蠟包埋機，Leica RM2255全自動輪轉切片機、Leica ST5020+SV5030全自動染色封片一體機，Leica DM3000正置熒光顯微鏡。

采用的試劑有1%鹽酸乙醇分化液(褪色劑)、胰島素抗原(Gene Tex公司)、PBS緩沖液(博士德生物公司)、胰蛋白酶(南京建成生物工程研究所)、免疫染色封閉液(碧云天生物公司)、熒光二抗(Invitrogen Life Technologies公司)、二甲苯(天津市百世化工公司)、無水乙醇(廣州中南化學有限公司)、95%乙醇(廣州凱秀貿易有限公司)、1%醇溶性伊紅(廣州凱秀貿易有限公司)、Harris蘇木精(廣州凱秀貿易有限公司)、TO透明劑(廣州市中南化工儀器有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1分組 選取3只血糖正常的食蟹猴胰腺常規脫水包埋后的蠟塊標本，連續切片后用多聚賴氨酸防脫玻片撈片，分為4組，每組3張，即：空白切片高壓修復免疫熒光組(A組)，空白切片胰蛋白酶修復免疫熒光組(B組)，HE切片褪色后高壓修復免疫熒光組(C組)，HE切片褪色后胰蛋白酶修復免疫熒光組(D組)。

1.3.2HE染色 使用未進行染色的空白切片烤片，然后在二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中分別浸泡20 min進行脫蠟，梯度乙醇脫水至純水，每個步驟7 min。Harris蘇木精染色10 min，蘇木精染色結束后再置于自來水中浸洗1 min，然后進行1%鹽酸乙醇分化5 s，再轉移到自來水中返藍15 min。 待返藍結束后轉移到90%乙醇浸泡7 min，然后進行1%醇溶性伊紅染色30 s，在伊紅染色后轉移到95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ以及95%乙醇Ⅲ中分別浸泡10 s，然后分別轉移到無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ中脫水各5 min，最后在TO透明劑Ⅰ、TO透明劑Ⅱ中分別浸泡7 min，封片。

1.3.3免疫熒光染色 A組：使用未進行染色的空白切片烤片，脫蠟，梯度乙醇水化后PBS沖洗3次、每次5 min，高壓修復(高壓鍋噴氣后5 min停止加熱，待自然冷卻至室溫)，PBS沖洗3次、每次5 min，熒光封閉液封閉1 h，一抗孵育(4 ℃冰箱過夜)，復溫(37 ℃ 60 min)，PBS沖洗3次、每次5 min，二抗孵育(37 ℃ 60 min)，PBS沖洗3次、每次5 min，晾干，封固。B組：與A組比較，抗原使用1.25%胰蛋白酶修復(37 ℃ 30 min)，不使用高壓修復，其余與A組方法步驟相同。C組：使用進行過HE染色的切片二甲苯浸泡，去除蓋玻片和中性樹膠，梯度乙醇水化褪色，放入用75%乙醇配制的1%鹽酸乙醇分化液中浸泡1 min，待晾干后，再放入1%的鹽酸乙醇分化液中1 min，反復數次直至顏色完全褪去，然后用自來水緩慢沖洗。接著使用PBS沖洗3次、每次5 min，進行高壓修復等與A組相同的步驟和方法進行免疫熒光染色。D組：與C組比較，抗原使用1.25%胰蛋白酶修復(37 ℃ 30 min)，不使用高壓修復，其余步驟與C組方法相同。

1.3.4病理組織學觀察 使用顯微鏡進行組織學觀察。C、D組在HE褪色前進行鏡下觀察和拍照，不同組不同動物的免疫熒光染色切片使用同一熒光強度和倍數觀察、拍照。

2 結果

HE染色鏡下觀察，見胰島大小不一、散在分布，胰島細胞呈團索狀分布，胞質淡染。各組胰島中均可見INS陽性熒光表達的胰島β細胞。A、C組切片可見部分組織破碎、脫落，B、D組切片未見破碎、脫落。各組各區域綜合比較，陽性細胞明亮、清晰，各組間抗原表達強度、染色效果未見明顯差異(圖1～4)。

圖1 HE切片褪色后高壓修復免疫熒光組：可見胰島中β細胞呈強陽性，細胞明亮、清晰 圖2 HE切片褪色后胰蛋白酶修復免疫熒光組：可見胰島中β細胞呈強陽性，細胞明亮、清晰 圖3 空白切片高壓修復免疫熒光組：可見胰島中β細胞呈強陽性，細胞明亮、清晰 圖4 空白切片胰蛋白酶修復免疫熒光組：可見胰島中β細胞呈強陽性，細胞明亮、清晰

3 討論

HE染色是組織病理學檢查的常規檢查方法[2]，石蠟切片在行HE常規染色步驟包括有機溶劑脫蠟、梯度乙醇水化、蘇木精染色、1%鹽酸乙醇分化、伊紅染色、梯度乙醇脫水、有機溶劑透明、封固等[3]，操作過程在常溫下進行，整個HE染色過程未接觸破壞抗原的溶劑及實驗條件，抗原得到較好的保存。常用的樹脂等封片劑由于溶于有機溶劑二甲苯[4]，經二甲苯充分的浸泡可除去蓋玻片并去除組織上附著的封片劑。1%鹽酸乙醇分化液的浸泡可對蘇木精染色的組織細胞進行褪色[5]，有研究報道HE切片經過數次浸泡可進行褪色[6]，提示其對伊紅也有褪色作用，本實驗使用1%鹽酸乙醇分化液對HE染色的切片有較好的褪色效果，鏡下未見組織細胞的蘇木精或伊紅著色。

本實驗觀察到完成褪色的標本，按常規方法和程序進行免疫熒光染色即可得到較理想效果。同一抗原修復方法下的比較顯示，HE褪色后進行染色的切片與空白片直接染色的切片比較，抗原表達強度相當，提示HE染色及褪色后INS抗原保存得較好。有研究表明酶消化能較好的修復抗原[7-8]，本實驗顯示，對于INS抗原，使用高壓和胰蛋白酶修復均取得較佳染色效果，但胰蛋白酶消化的切片組織塊不易發生破碎、脫落，較好的保留了待觀察組織的完整性。