一種分析肝細胞肝癌免疫和循環微環境的新方法

尹燦昆，賽音·賀西格，宿杰·阿克蘇，紀 元

病理組織大切片相比常規切片，可對肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)部分肝臟手術標本的最大切面的形態和免疫微環境進行廣泛分析，是一種已被廣泛開展使用的方法[1]。共聚焦熒光顯微切片可從三維角度對腫瘤免疫微環境進行更為細微的觀測，配合多重抗體標記和熒光顯色多通道切換，同一張切片可反映數種免疫細胞和蛋白的分布情況和表達量[2]。本實驗將結合上述兩種研究方案，利用掃描所得的高精度全息圖像，從廣度和深度上共同拓展探究HCC脈管及免疫微環境新技術的可行性與優越性，截取并記錄相應的具有臨床或實驗研究價值的信息以供證明。

1 材料與方法

1.1 材料收集2018年3～12月在復旦大學附屬中山醫院首次診斷為HCC并行根治性切除術的患者，術后病理診斷為HCC的手術標本。以腫瘤長徑2～5 cm，標本總長徑不超過7 cm為標準獲取數例標本適用于行病理組織大切片制作。經篩選，10例HCC切除標本被制成病理組織大切片，10例HCC標本均存在HBV感染，組織學分化為Ⅱ～Ⅲ級。10例中有1例因腫瘤大小適中、熒光染色效果較好，被用于制作共聚焦熒光顯微切片。

1.2 方法除共聚焦熒光顯微切片需經4%多聚甲醛固定、冷凍切片和行多重免疫熒光染色，其余均經10%中性福爾馬林固定和石蠟包埋切片、行HE和免疫組化EnVision染色，抗體包括CD3(LN10)(Leica公司)、CD8(4B11)(Abcam公司)、CD34(QBEnd/10)(長島公司)、E-cadherin(Dako公司)。

2 結果

成功獲取實驗所需的HCC大切片及共聚焦熒光顯微切片，并對具有一定臨床實驗價值的圖像進行了觀測，初步探索并得到具有一定研究意義的結果。

2.1 取材、制片

2.1.1大切片巨檢取材制片 取材流程包括：標本取材前拍照；大切片、共聚焦和常規取材定位(圖1A)；剩余標本完整取材。切片可完整包含標本的最大切面，組織斷面面積一般是小切片的4～6倍(圖1B)。腫瘤最大切面的整體形態在大切面上得到完整呈現，其旁間質增生反應區和周圍肝臟彼此也能較好區分。

圖1 肝細胞肝癌大切片取材及成片效果：A.大切片、共聚焦和常規取材同步進行；B.大切片與一般病理切片成片效果對比

2.1.2共聚焦熒光顯微切片制片 1～2 mm厚度的HCC組織經多聚甲醛固定和蔗糖溶液脫水用于制作共聚焦熒光顯微切片，因這類組織比常規冷凍切片大很多，所以需要承載面更大的冷凍頭來進行切片。經探究，將OCT冷凍后涂布在冷凍頭上，反復冷凍可拓展冷凍頭承載面(圖2A)。將切好的切片撈入標記抗體所用的十二孔板可對組織充分染色，而實驗撈、爬片所用的針灸針則是一類可不傷及樣本的制片工具，易獲取，便于攜帶(圖2B)。抗體標記完成后經充分洗滌，最后封片用于掃描成像。

圖2 共聚焦免疫熒光厚切片取材制片要點：A.利用OCT反復涂布/冷凍，拓展承載范圍； B.PBS懸浮漂洗組織切片并使用針灸針制成的撈片器具爬片

2.2 觀測

2.2.1大切片 觀測10例大切片中，有1例HCC具有極為豐富的形態學改變狀態，包括了癌前病變、腫瘤脂肪變/播散灶形成(圖3)和微脈管癌栓廣泛播散。這些診斷位點均位于同1張大切片上，可迅速、全部觀測到。

圖3 1例大切片案例內具有多種形態-免疫學改變的肝細胞肝癌及周圍組織，包含脂肪變、大細胞變和免疫細胞熱點

2.2.2共聚焦 熒光顯微切片觀測HCC血管新生伴炎細胞集中與浸潤，常規免疫組化切片的厚度有限，且因為抗體標記后辨識度較低，僅能粗略的對標本的血管豐度和分布情況進行估計，血管的層次、細微結構及周圍腫瘤、免疫細胞浸潤層次則較難進行判讀。共聚焦熒光顯微切片厚度已達到立體觀測要求，復合熒光染色配合光線通道切換，既可單獨觀測血管的結構或淋巴細胞的分布狀況，又可復合后進行聯合判讀以對各類細胞間的關系進行細分和統計。一方面，T細胞廣泛分布在HCC周圍肝臟，并集中分布在膽管內，少有分布于HCC內部的案例。另一方面，常規免疫組化切片中的T細胞集中分布區域內的T細胞陽性染色堆疊與重合均會影響計數，造成數據失真(圖4A)。共聚焦熒光顯微切片可較好的凸顯T細胞在炎癥熱點中的位置，標記效果顯著優于常規免疫組化，堆疊形成的復合圖像具有明顯的空間感，較易計數(圖4B)。對實際面積相同的免疫組化與共聚焦免疫熒光切片計數后再進行對比，結果表明它們在腫瘤內部、間質增生反應區、膽管增生區和周圍肝臟內的T細胞表達強度(單位面積T細胞數目)上差異有統計學意義(圖4C)。

圖4 同一案例普通免疫組化切片和共聚焦熒光顯微厚切片成像和細胞計數結果對比：A.普通切片成像效果；B.共聚焦熒光顯微成像效果；C.單位面積計數結果對比(Image J計數，Graphpad 7.0制圖)

3 討論

HCC是一種常見的消化系統惡性腫瘤，具有高侵襲性、復發性及致死性的特點。放、化療和介入治療雖能使臨床治愈腫瘤，但無法修復肝臟的內環境，特別是免疫微環境，從而無法消除HCC復發和轉移的溫床。免疫治療作為一類新興的腫瘤治療方法，不僅可以重新激活或強化淋巴細胞殺傷腫瘤細胞，更具有使組織微環境恢復穩態的潛能。然而，這需要對腫瘤的免疫微環境進行系統詳盡的觀測和及時監控，因而一系列更為先進的觀測手段有待進一步開發，特別是不破壞組織結構的形態-免疫綜合研究[3]。病理學上，普通的HE和免疫組化切片顯然已不能滿足日益增長的腫瘤微環境精準觀測需求，若進行常規取材，則需分區域分別采集，導致觀察不連續，同時又可能造成遺漏，從而影響標本評估和診斷的準確性[4]。病理組織大切片作為提示形態學特異性改變和免疫微環境變化的載體，涵蓋了標本切面所有可能具有病理學意義的位點，是一種良好的圖像觀測和數據收集載體。本實驗自創的HCC共聚焦顯微切片在對具有多種形態分化、多侵犯轉移傾向的HCC信息反饋上具有比常規切片更大的優勢，所包含的潛在的有臨床價值的位點數目也更多更全。現當務之急是需要開發一類可對其進行掃描的、適配多尺寸玻片的切片掃描儀，從而解決這類切片的數字化管理問題。此項研究表明，HCC大切片不僅可行，而且可涵蓋更豐富的組織學信息，相較于側重診斷的肝臟多點取材法，大切片則更適用于需要更多方面獲取信息的肝臟組織學實驗，且同時省略了后續診斷后補充取材這一過程，在后續輔助診斷和實驗中也有更多的選材斡旋余地。另一方面，共聚焦熒光顯微切片是本實驗的難點，但它也從立體角度進一步豐富了組織切片的觀測豐度與層次，解決了在同一張切片行多種免疫組化染色并聯合觀測，可較為清晰反映組織空間細微結構和免疫細胞的分布情況，與傳統玻片相比，是一種更適合進行形態-免疫綜合量化分析的工具，能夠反應常規免疫組化所不能體現的血管細微結構、細胞對組織浸潤的層次和局部炎癥熱點的各類細胞分布情況。本實驗結果均表明共聚焦熒光顯微切片具有替代傳統免疫組化切片，進行免疫微環境數字化分析的潛力。然而目前亟待解決的問題是如何研發可以以較低的代價進行大批量生產的技術平臺，如何開發和完善出可深度量化分析的多能數字切片分析工具、如何捕捉和匯總共聚焦熒光顯微數字切片內所包含的、可能具有臨床和預后價值的圖像信息和如何對所得到的數據進行合適的統計學分析[4]。

肝臟的炎癥高表達和HCC免疫細胞低表達于HCC中共存，表明HCC的免疫微環境中存在的免疫細胞與肝臟內的免疫細胞極有可能在分化和功能上均存在差別，亟需鑒別并細分HBV感染相關、HCC腫瘤免疫相關和非功能性免疫細胞。實驗同樣觀測到，在出現轉移傾向的區域(腫瘤包膜突破浸潤、子灶、部分MVI)可見大量T細胞浸潤，這也表明HCC的復發和轉移與T細胞有較大關系。實驗中T細胞在腫瘤內部表達出現缺失或陽性減弱，但在周圍肝臟組織內的表達并未受到影響，表明不同區域的免疫細胞有著不同的激活來源，同時在表達的過程中會因微環境的改變而發生轉分化、表達缺失和再激活等改變[5-7]。

作者在進行HCC免疫微環境全面量化的過程中嘗試了以大切片引導、共聚焦熒光顯微切片定位分析的方案。病理組織大切片結合共聚焦熒光顯微切片，在人HCC的微環境再現、觀測和量化上，要優于普通的HE和免疫組化切片，但其制作成本及難度也大大限制了其應用范圍。這種方案經試驗驗證，具有一定的可行性，有望在大切片掃描、全層等相關技術成熟后，以數字切片的方式進行多維深層次量化分析，成為更豐富且更為準確的免疫微環境量化數據的來源。