病理制片中微小病變組織的優化和改進

王守梅，朱詩琦，周 睿，朱美琪，方 媛，張樹輝

在日常病理操作和制片過程中經常會發現微小病變組織，一類是送檢組織較小，如內窺鏡活檢組織；另一類是送檢組織較大，但病變區域特別小，有的僅有幾毫米，甚至僅有幾團細胞。面對如此微小的病變組織，在經過取材、脫水、包埋、切片及進一步檢測時如何盡可能多地保留病變組織，作者結合自身經驗和學習探討，現就如何保證微小病變組織的制片質量談幾點體會。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器隨機選取2018年5月～2019年5月上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院病理科存檔的微小病變組織標本，對照組與實驗組各50例；貝索蘇木精染色液；貝索伊紅染色液；Leica ASP300全自動脫水機、Leica EG1150石蠟包埋機、Leica RM2235石蠟切片機，Leica ST5020全自動染色機、Leica CV5030封片機、Leica Bond Max全自動免疫組化儀。

1.2 方法微小病變組織標本對照組按照正常流程操作，實驗組經以下幾方面進行優化和改進，其余過程兩組相同。組織脫水和包埋后3～5 μm厚連續切片，后經過漂片、烤片，在全自動染封一體機中進行染色和封片制作HE切片或制作白片進行進一步免疫組化檢測和其它檢測項目。

1.2.1取材操作 接收到10%中性緩沖福爾馬林固定的標本后的第一關卡便是取材，標本信息核對準確無誤后，如果發現組織很小或病變區域很小時，首先可以將組織用伊紅做標記后包入紗布或濾紙中防止標本由于過小而失落[1]，其次在包埋盒中加入“少修條”以提醒工作人員在后續包埋時提高注意，最后初步判斷如需做進一步檢測時直接在申請單上標注出，在常規切片時直接切出相應的白片以備用。

1.2.2包埋操作 包埋時可以先在包埋模具中注入一半量熔化的蠟液，然后將包埋模具置于冷臺上，用鑷子將組織轉移到包埋模具中[2]。在包埋過程中查見帶有少修條的包埋盒時應當特別注意，仔細觀察微小病變組織的包埋面，否則制作出來的切片會觀察不到組織的全層結構，難以作出正確診斷。包埋大塊組織中的微小病變區域時，要注意包埋面的平整，防止修片時修掉病變區域。包埋結束時將少修條放在包埋框上方的液體石蠟上，待石蠟凝固后少修條則會緊緊嵌入石蠟中(圖1)。

圖1 包埋時將少修條放在包埋框上方 圖2 在多張待檢白片上標上序號，按序號漂片并做相應檢測項目

1.2.3切片操作 在切片過程中發現帶有少修條的蠟塊時應當特別注意，仔細觀察微小病變區域的位置，切片時要用力均勻，少粗修多細修，隨時注意病變組織的暴露情況，一旦病變組織暴露，盡量原位原切，不更換新的刀口防止刀口間有距離差并避免新刀口靜電吸附。切片3～4 μm厚為佳，切忌邊切片邊調整厚度。

1.2.4加做檢測操作 在診斷過程中由于病變部分太小，大大增加了診斷的難度，有時候需加做免疫組化等指標來輔助診斷。對于微小病變區域，有時候連續切片的同一蠟片條帶上，第一個蠟片與最后一個蠟片上的病變細胞數量差異較大。將需要做的檢測項目按照重要程度進行排序，最重要的指標放在首位，同時相應的在切片上標注序號，將第一個蠟片放在第一張切片上做排序中的第一個檢測項目(圖2)，將連續切片的最后一張行HE染色以確認病變細胞多少。

1.3 染色HE染色：常規制作HE切片后，在70 ℃烘片機上烤片15 min，全自動染封一體機(Leica ST5020全自動染色機和Leica CV5030封片機)進行HE染色和封片：二甲苯10 min×3次、100%乙醇1 min、95%乙醇1 min、75%乙醇1 min、流水沖洗1 min、蘇木精8 min、分化液20 s、流水沖洗3 min、藍化液1 min、流水沖洗3 min、伊紅1 min、75%乙醇1 min、95%乙醇1 min、100%乙醇1 min×2次、二甲苯5 min×3次，封片后結束HE染色程序。免疫組化染色：將編號后的白片與醫師開據的重要檢測項目的序號一一對應后使用Leica Bond Max全自動免疫組化儀進行染色，機器設置程序：加熱抗原修復20 min，冷卻至室溫，PBS漂洗，3%H2O2溶液封閉內源性過氧化物酶活性，加一抗20 min，Post Primary 10 min，Polymer 10 min，DAB顯色10 min，蘇木精復染，水洗后將玻片從機器中取出，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.4 優化和改進操作后制作HE切片及免疫組化切片的檢測結果對比HE染色切片及免疫組化染色切片由兩名高級別病理醫師鏡下閱片進行診斷及制片質量打分。HE切片質量及免疫組化切片質量評分根據病變區域情況進行評分：不能滿足診斷需求為1分，基本滿足診斷需求為2分，較好滿足診斷需求為3分，非常滿足診斷需求為4分。

1.5 統計學分析采用SPSS 24.0軟件進行統計學分析，惡性組織檢出率的比較采用χ2檢驗，檢驗水平α=0.05，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HE切片質量微小病變組織經優化和改進操作后，內窺鏡組織無遺漏現象，包埋組織集中，HE切片的切面較為完整，鏡下見組織結構和細胞形態清晰，實驗組與對照組相比，差異有統計學意義(P<0.05，表1)。

表1 HE切片質量實驗組與對照組相比

2.2 免疫組化切片質量微小病變組織蠟片越往后切病變組織越少，經編號后切白片制作免疫組化切片，這樣就可以保證最前面的蠟片能進行有診斷意義的檢測項目，免疫組化切片質量評分，實驗組與對照組相比，差異有統計學意義(P<0.05，表2)。微小病變區域可較好地呈現在多張免疫組化片上，鏡下見組織結構和染色定位清晰準確，能較好地滿足診斷需求(圖3)。

表2 免疫組化切片質量實驗組與對照組相比

圖3 微小病變組織按序號進行HE染色(A)和CK7(B)、CK19(C)、CK20(D)免疫組化檢測

3 討論

病變組織過小、診斷者缺乏相應臨床經驗、取材和制片困難時，易發生漏診[3]。為了使小組織更醒目、更易識別，我們先將組織用伊紅滴染后包入紗布或濾紙中，隨后放入加了伊紅的10%中性緩沖福爾馬林中固定進行浸染以減少伊紅褪色，日常操作中不同單位的改進方法也不盡相同，有的單位使用蘇木精對小組織進行染色固定也取得了良好的效果[4]。微小病變組織的制片難度較大，我們要謹防丟失醫師診斷的關鍵依據。一般常規制片過程中3～5 μm厚切片，也就是說沒有完全相同的2張切片，包括連續切片時相鄰的2個蠟片。尤其在微小病變組織中，連續切片的蠟條上面第一個蠟片與最后一個蠟片上的病變細胞數量差異很大，這時最大程度地保證重要診斷項目就是我們首要的任務。經過長期的實踐，作者發現編號制片可以很好地滿足診斷需求。

在病理操作流程及制片過程中要非常小心，因為每一環節均很重要，均可能影響到最終的制片質量[5]。對待小組織，無論臨床醫師有無提醒注意，技術人員均要加倍注意，要有高度的責任心和嚴謹的工作態度，對病理操作流程的各個環節有充分的認識和掌握，在日常工作中謹慎再謹慎，不斷地思考、總結和改進，提高制片質量，最大可能地保證醫師診斷的關鍵依據。