石蠟切片的保存條件對免疫組化反應活性的影響

高麗麗，章宜芬，錢金林，蘇紅丹，李林秋，李 青

免疫組化染色技術是一種多步驟、多因素決定的實驗方法，染色過程中存在很多干擾因素[1]。組織如何保存是形態學研究的主要問題。生物樣本若冷凍或低溫儲存，可保存多年。用固定液浸泡標本是病理實驗室最常用的組織保存方法，組織固定后，石蠟包埋也可保存多年。包埋后的石蠟組織通常在行免疫組化染色前1～2天切片。實際工作中有時因組織太小不易再次切片；或者病理、科研工作中用的組織對照片會提前切片，存放太久的切片對組織抗原的影響尚未可知。有學者建議不要使用存放太久的切片進行染色，但是“太久”的定義并不明確。最近研究發現[2]，室溫下保存組織切片，ER和PR表達強度均明顯降低。本實驗用4種抗體在室溫、4 ℃、-20 ℃條件下對保存2～6個月的未染色切片進行免疫組化檢測，比較組織切片保存溫度及時間對免疫組化染色結果的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料羊膜卷組織(包含乳腺癌和闌尾組織)連續切片180張，羊膜卷組織的制作參考文獻[3]。

1.2 方法對180張組織切片進行編號(常溫1～60號，4 ℃ 1～60號，-20 ℃ 1～60號)，分為三組，并按不同溫度保存，每2個月分別抽取三組切片進行Ki-67、CKpan、GATA-3、desmin免疫組化染色。免疫組化染色均在Dako Link48全自動免疫組化儀上操作。

1.3 結果判定所有切片均經資深病理醫師進行閱片，每張切片在高倍鏡(40×)下觀察10個不同視野，每個視野計數100個細胞。Ki-67、GATA-3定位于細胞核，CKpan、desmin定位于細胞質。Ki-67陽性判定標準參照2018年《美國臨床腫瘤學會/美國病理學家協會乳腺癌激素受體免疫組織化學檢測指南》。Ki-67以≤20%為低表達，>20%為高表達[4]。GATA-3、CKpan和desmin染色計分：(1)按陽性細胞數所占百分比計分：陽性細胞數0～10%為0分、11%～25%為1分、26%～50%為2分、51%～75%為3分、76%～100%為4分。(2)按染色強度計分：無著色為0分、淺棕黃色為1分、棕黃色為2分、深棕黃色為3分。將兩項得分結果相乘：0～4分為低表達，6～12分為高表達[5]。

2 結果

2.1 切片的免疫組化染色把提前切取的組織片按組別分別在新鮮組織和保存2、4和6個月后組織進行4種抗體的免疫組化染色(圖1)。染色結果顯示：Ki-67、GATA-3和desmin在室溫和4 ℃保存均在6個月后出現染色強度降低的現象，-20 ℃保存條件下染色強度一致；CKpan在4 ℃保存6個月后出現染色強度降低的現象，在室溫和-20 ℃保存條件下染色均一致。

圖1 乳腺癌組織中Ki-67的免疫組化染色，EnVision法：A.室溫保存6個月后的切片染色；B.-4 ℃保存6個月后的切片染色；C.-20 ℃保存6個月后的切片染色；D.新鮮切片染色

2.2 Ki-67、CKpan、GATA-3、desmin抗體的染色分類Ki-67：常溫和4 ℃保存6個月后的切片表達強度均由之前的8分降為4分。GATA-3：常溫和4 ℃保存6個月后的切片表達強度均由之前的12分降為6分。desmin：常溫和4 ℃保存6個月后的切片表達強度由之前的9分降為6分，而-20 ℃保存6個月后的切片表達強度與之前一致。CKpan：4 ℃保存6個月后的切片表達強度由之前的12分降為8分，常溫和-20 ℃保存6個月后的切片表達強度與之前一致(表1)。

表1 Ki-67、CKpan、GATA-3、desmin抗體的表達強度比較

3 討論

有研究[6]發現乳腺癌組織切片保存12周后其中p53免疫反應活性明顯下降，認為抗原和組織的保存條件可能是免疫染色結果改變的潛在原因。林興滔等[2]也比較過ER、PR和HER-2在切片保存2年后組織抗原反應活性的變化。本組實驗增加了時間梯度，切片保存2、4、6個月后對病理科常用的4種抗體進行檢測，因為在臨床病理工作中這4種抗體在判斷腫瘤來源和細胞增殖活性方面使用頻率較高。

本實驗發現，切片保存的時間和溫度會導致組織抗原丟失，影響免疫組化染色結果，導致假陰性現象。對于核表達(如Ki-67和GATA-3)的抗體更易發生抗原丟失，4 ℃和常溫保存6個月后的切片出現明顯的染色強度降低。胞質表達的抗體(desmin)也較易受時間和溫度的影響。但是CKpan 4 ℃保存比常溫保存更易發生抗原丟失，推測可能與CKpan蛋白表達模式或者組織內源性/外源性水分相關。Xie等[7]研究發現環境中濕度也會影響抗原的保存，室溫下的干燥貯藏條件優于冷藏條件下的潮濕貯藏條件。因此，本實驗認為低溫干燥的環境有利于切片抗原的保存。

抗原反應活性降低常發生在石蠟切片上，并未發生(或在一個非常低的水平)在組織蠟塊中。提示切片暴露于空氣中可能與抗原改變有關。唐錦玲等[8]報道石蠟組織塊保存時間對細胞質表達定位抗原的影響輕微。

用于病理診斷的免疫組化染色通常在保存1～2天的新鮮切片上進行。然而，對于會診病例或科研工作，抗原改變可能是一個真正的問題。通常情況下，病理科會診切片一般是外借組織切片，尤其國外會診，切片郵寄時間過久，如p53，僅保存幾周就可能引起抗原的改變[6]。因此我們應重視切片保存對免疫組化染色的影響。

當無法避免使用長期保存的切片時，作者建議實驗人員應首先證明抗原反應活性是否有效，即長期保存的切片與最近切片染色結果是否一致。其次，探究組織切片抗原最佳保存條件。

由于本實驗樣本量少，僅檢測了保存6個月內的切片，后續需增加樣本量，繼續觀察；抗原反應活性還可能取決于組織類型或者抗原的氧化，在后續實驗中可增加組織類型或者密閉保存減少切片在空氣中的暴露，進一步分析原因；另外應考慮水分對抗原活性的影響。總之，要提高免疫組化染色技術，不但要注意標本的固定、切片、染色等環節的規范操作，而且還要在實際工作中不斷摸索，完善免疫組化技術，只有這樣才能更好地解決實際工作中的問題，為病理診斷提供有力的技術保障。