雙氫青蒿素對人胃癌細胞BGC-823細胞增殖、凋亡的影響及機制研究

徐彥楠，孟 麗，朱 艷，閆 靜，王彥玲，周晨明*

(1.河北醫科大學教學實驗中心，河北 石家莊 050017；2.河北醫科大學電鏡實驗中心，河北 石家莊 050017;3.河北醫科大學細胞生物教研室，河北 石家莊 050017)

胃癌是世界上常見的消化道惡性腫瘤之一，對人類的健康造成巨大威脅。其發病率和病死率分別位于世界惡性腫瘤第4位和第2位[1]。目前，在臨床上主要通過手術切除病灶來治療癌癥改善病情。但是臨床癥狀對于胃癌早期患者來說并不明顯，以至于就診率很低。并且目前在診療過程中缺乏診斷胃癌的生物學指標，導致眾多出現臨床癥狀的患者在確診時已是伴有轉移的中晚期胃癌[2]。最佳手術治療時期已經錯過，非手術治療是唯一緩解病情的方式。目前，放療與化療已被廣泛應用于中晚期腫瘤的非手術治療中，但在治療過程中容易出現不良反應，甚至出現器官衰竭。因此，尋找高效低毒的天然藥物至關重要。青蒿素是1971年我國科學家在中草藥青蒿中分離出的環狀倍半萜類化合物，是一種低毒、高效治療瘧疾的天然藥物。青蒿素難溶于水，使其療效不能充分的發揮，因此合成了抗瘧效果強于青蒿素且低毒、安全的青蒿素衍生物——雙氫青蒿素(dihydroartemisinin，DHA)。有研究表明，DHA對宮頸癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、淋巴癌和前列腺癌等腫瘤細胞的生長有明顯地抑制作用[3-8]，但是否能抑制人胃癌細胞BGC-823細胞及其作用機制的研究尚未報道。因此，本研究旨在探討DHA抑制人胃癌細胞BGC-823細胞增殖并促凋亡的作用及作用機制，以期為中藥抗腫瘤藥物的開發提供依據。

1 材 料 與 方 法

1.1實驗材料 人胃癌細胞系BGC-823細胞；DHA購自美國Sigma公司；RPMI1640培養基購自美國Gibco公司；噻唑藍(methylthiazoletetrazolium,MTT)購自美國Pharma Minger公司；兔抗人Bax、Caspase-3、Caspase-8單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；羊抗兔二抗購自康為世紀生物試劑公司；倒置顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；倒置熒光顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；二氧化碳培養箱購自美國Formascientific公司；酶標儀購自美國Bio-Rad公司；電泳儀購自比利時Consort公司；超薄切片機UC7購自德國徠卡公司；流式細胞儀購自美國BD公司；透射電子顯微鏡H-7500購自日本日立公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 BGC-823細胞在含有10%胎牛血清的RPMI1640培養基中培養，置于CO2培養箱中，每周傳代2～3次，維持細胞處于對數生長期。

1.2.2MTT法檢測DHA對BGC-823細胞的抑制率 取對數生長的BGC-823細胞，棄培養基，用PBS進行清洗，加入0.25%胰酶進行消化，用培養基調成單細胞懸液，接種到96孔板上，置于培養箱中培養過夜，待貼壁后根據分組加入不同濃度的DHA[0(對照組)，0.67，1.34，2.68，5.36，10.72 μmol/L]生長24，48，72 h。定時觀察細胞生長情況，每孔加入5 g/L MTT 溶液20 μL/孔，孵育4 h后，棄上清加入150 μL/孔 二甲基亞砜。利用酶標儀以波長490 nm測各孔吸光值(absorbance，A)，根據下列公式計算DHA對BGC-823細胞的抑制率：抑制率(%)=(1-實驗組A/對照組A)×100%，并將上述計算結果用82798-IC50軟件計算出DHA作用的半數抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)。

1.2.3流式細胞術(flow cytometry,FCM)檢測凋亡率 實驗分組為對照組、1.7 μmol/L組、3.4 μmol/L組、6.8 μmol/L組。在細胞培養瓶中以1×105個/mL的濃度接種5 mL BGC-823細胞，24 h后在對照組加入3 mL培養基，實驗組中分別加入3 mL終濃度為1.7、3.4、6.8 μmol/L DHA，之后繼續在CO2培養箱中培養48 h，終止培養并收集細胞。細胞經0.04%乙二胺四乙酸消化，離心，收集細胞。用預冷PBS重懸，離心、清洗兩次，用體積分數為70%乙醇吹打制成單細胞懸液。上機檢測前棄乙醇，用PBS清洗重懸，取單細胞懸液0.1 mL，加入1 mL碘化丙啶染液，將其置于4 ℃冰箱避光繼續孵育30 min，以500目銅網過濾，用流式細胞儀進行分析檢測凋亡率。

1.2.4DHA對BGC-823細胞凋亡的形態學影響 分組同FCM，每組均做3個復孔，給藥方式同FCM，繼續培養48 h后離心，棄上清，PBS洗滌，用4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌，DAPI避光孵育3 min，PBS清洗后置于熒光顯微鏡下觀察、拍照。收集細胞，離心成團，棄上清，加入2.5%戊二醛進行前固定、1%四氧化鋨后固定1.5 h、經50%、70%、80%、90%、100%丙酮梯度脫水、Epon812樹脂包埋、超薄切片機切50 nm超薄切片、醋酸雙氧鈾及檸檬酸鉛染色各30 min，在透射電子顯微鏡下檢測、拍照。

1.2.5Western blotting檢測相關蛋白表達 細胞分組及處理同FCM，繼續孵育48 h后，經預冷的PBS洗滌，用裂解液裂解60 min，測定蛋白質濃度。之后進行蛋白電泳和轉膜，再進行免疫反應：將膜用5%脫脂奶粉37 ℃封閉2 h，加入兔抗人Bax、Caspase-3、Caspase-8孵育，4 ℃冰箱過夜；TBST洗滌3次后，與辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗孵育1 h，TBST洗滌3次，滴加發光液，顯影并采用凝膠圖像系統分析。

1.3統計學方法 應用SPSS13.0統計軟件分析數據。計量資料比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1不同濃度DHA對BGC-823細胞的增殖活性的影響 不同濃度DHA作用于BGC-823細胞后，其抑制率隨藥物濃度的增加而增大，且隨著時間的延長而增大，具有顯著的劑量和時間依賴性，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。DHA作用的IC50為3.4 μmol/L。

表1 不同濃度DHA對BGC-823細胞的抑制率比較

2.2FCM檢測DHA對BGC-823細胞凋亡的影響 隨著DHA藥物濃度的增加，凋亡峰愈加明顯，并呈現出劑量依賴性。差異有統計學意義(P<0.01)。見表2，圖1。

2.3DHA對BGC-823細胞凋亡形態學的影響 熒光顯微鏡觀察細胞凋亡的形態特征，對照組呈現淡藍色熒光，且分布均勻、形態完整；隨著DHA濃度的增加，實驗組BGC-823細胞表現為細胞核固縮，藍色熒光增強，部分細胞核呈現顆粒團狀染色質或碎裂成許多球形顆粒物質，見圖2。透射電子顯微鏡觀察細胞凋亡的形態特征：對照組細胞器豐富，細胞核染色質分布均勻；1.7 μmol/L組細胞輕度固縮，染色質電子密度增加，邊集于核膜下；3.4 μmol/L組細胞固縮加重，核膜下染色質邊集進一步增厚；6.8 μmol/L組細胞體積明顯縮小，胞質高度濃縮，染色質邊集更加明顯，見圖3。

表2 FCM檢測不同濃度DHA作用48 h后BGC-823細胞凋亡率比較

2.4DHA對BGC-823細胞凋亡相關蛋白Bax、Caspase-3、Caspase-8的影響 Western blotting結果表明，BGC-823細胞隨著DHA用藥濃度的增大，Bax、Caspase-3、Caspase-8條帶變寬、變深。細胞中Bax、Caspase-3、Caspase-8蛋白表達隨著DHA給藥濃度的增加而增高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3，圖4。

表3 不同濃度DHA及對照組作用48 h后BGC-823細胞Bax 、Caspase-3、Caspase-8蛋白表達

Figure 3 BGC-823 cells morphology using transmission electron microscope

3 討 論

我國每年新增的胃癌患者約為67.9萬，死亡約為49.8萬，占全球總人數的45%[9]。雖然近些年，通過改善飲食習慣、降低危險因素等方法，胃癌發病率逐年降低，但仍是常見的惡性腫瘤之一。抑制腫瘤生長是目前臨床治療腫瘤的重要途徑。DHA是青蒿素的主要衍生物，對多種組織的人類惡性腫瘤具有明顯的細胞毒性作用[3-8]。為了考察DHA抗胃癌的作用和機制，本研究采用人胃癌細胞BGC-823細胞探討DHA抗胃癌的效果及機制。本實驗通過MTT檢測DHA對人胃癌細胞BGC-823細胞增殖活性的影響，結果顯示DHA對BGC-823細胞增殖的抑制作用明顯且具有時間和劑量依賴性。

在MTT檢測過程中，通過倒置顯微鏡可見用藥組細胞凋亡現象明顯。細胞凋亡是一個高度調控的細胞死亡過程，主要負責清除那些已經高度損壞、被破壞、老化和不可修復的細胞，以維持多細胞生物的正常生理過程。細胞凋亡出現異常可以導致和促進多種疾病如：自身免疫性疾病、神經退行性疾病、心臟病和癌癥等的發生[10-12]。因此，涉及細胞凋亡調控的因素對疾病的診斷和干預有著巨大的價值。本實驗通過 FCM檢測發現隨著DHA給藥濃度的升高，細胞凋亡率也隨之升高，表現為明顯濃度依賴性。進一步通過熒光顯微鏡及透射電子顯微鏡觀察，發現用藥組細胞隨著給藥濃度的升高，細胞凋亡形態的變化更加明顯，與FCM結果一致。

Caspases是屬于半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的一類蛋白質，在凋亡的過程中發揮著重要的作用[13]。內源性和外源性凋亡都依賴于Caspases家族成員的激活。在細胞凋亡之前，細胞的表面受體會傳遞一種來自細胞外微環境的死亡信號，“死亡”配體與其受體結合，形成誘導死亡的信號復合體，然后激活Caspase-8，進一步激活Caspase-3，從而引發細胞凋亡[14]。Caspase-8主要位于線粒體，少數位于胞質和胞核中，其介導TNFR1等死亡受體誘導的細胞凋亡，是凋亡途徑關鍵的啟動者[15]。Caspase-3是整個凋亡通路的中樞，是Caspase凋亡級聯通路的效應體，Caspase-3在啟動外部凋亡通路和內部凋亡通路后均被激活，其作為細胞凋亡的執行者，通過特異性地裂解底物最終導致細胞凋亡[16]。Bax 又稱成孔蛋白，是Bcl-2家族中經典的促凋亡因子，在調節細胞凋亡中發揮著重要的作用[17]。它可以在線粒體外膜上形成孔，導致線粒體的破壞并使細胞色素C釋放增加，與Apaf-1相互作用，導致Caspase-9的激活，引起Caspases 的級聯反應，最終導致細胞凋亡[18]。有研究表明，Bax、Caspase-3、Caspases-8基因的激活促進細胞凋亡[19]。本實驗通過Western blotting測定Bax、Caspase-3、Caspase-8基因表達，結果顯示其表達量用藥組高于對照組，提示DHA可以使Bax、Caspase-3、Caspase-8的表達增加，進而誘導細胞凋亡。

由此可見，DHA對BGC-823細胞的增殖具有明顯的抑制作用，其誘導凋亡的機制可能是通過上調Bax、Caspase-3、Caspases-8的表達而起作用，但DHA誘導凋亡信號通路的具體分子機制有待進一步研究。