HPV18在不同病理類型宮頸癌中miRNA表達差異研究

劉 淼，張曉曉，李瑞珍，葉 靜，烏蘭娜

(1.北京大學深圳醫院婦科，廣東 深圳 518036；2. 北京大學深圳醫院中心實驗室，廣東 深圳 518036)

宮頸癌在我國臨床具有較高的發病率，其發生與高危型人類乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染有密切的關系，高危型HPV是宮頸癌發生的必要條件，故高危型HPV感染是臨床研究重點。宮頸腺癌與宮頸鱗癌的預后存在一定差異[1-2]。另外，有研究顯示，HPV18感染可能與宮頸腺癌的發生有關，感染HPV18的宮頸癌前病變進展更快，因此對于HPV18感染宮頸癌患者的miRNA表達差異研究意義較高[3-4]。本研究就HPV18在不同病理類型宮頸癌中miRNA表達差異進行探究，現將結果報告如下。

1 資 料 與 方 法

1.1一般資料 選取2016年7月—2018年6月期間北京大學深圳醫院的30例HPV18陽性宮頸腺癌患者為A組，同時期的30例HPV18陽性宮頸鱗癌患者為B組，同時期的15例宮頸正常者為C組。A組年齡29～65歲，平均(46.2±5.0)歲，其中≤45歲者15例，>45歲者15例；分期：Ⅰ～Ⅱ期者13例，Ⅲ～Ⅳ期者17例；分化程度：高分化者11例，中分化者10例，低分化者9例；轉移情況：是者13例，否者17例。B組年齡29～65歲，平均(46.5±5.5)歲，其中≤45歲者15例，>45歲者15例；分期：Ⅰ～Ⅱ期者15例，Ⅲ～Ⅳ期者15例；分化程度：高分化者11例，中分化者10例，低分化者9例；轉移情況：是者12例，否者18例。C組年齡26～60歲，平均(45.1±5.7)歲，其中≤45歲者8例，>45歲者7例。三組的年齡、A組與B組的分期、分化程度及轉移情況比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。納入標準：①年齡20～65歲者；②未進行相關治療者；③對研究知情同意者。排除標準：①進行化療放療及其他相關治療者；②合并其他高危型HPV感染者；③合并慢性基礎疾病者；④多系統器官功能不全者；⑤妊娠期及哺乳期者；⑥精神與認知異常者。

本研究經醫院醫學倫理委員會批準，患者簽訂知情同意書。

1.2方法 采集A組與B組的病灶組織標本、C組的正常宮頸組織標本送檢，標本收集后放-80 ℃保存。隨機選取HPV18陽性的宮頸腺癌和鱗癌組織標本各6例以及正常宮頸組織標本6例送往康成生物公司進行miRNA芯片表達檢測：樣品RNA抽提；RNA質量檢測；制備熒光標記探針；芯片雜交圖像采集。miRNA芯片檢測結果由數據分析員分析,通過芯片中位值對miRNA芯片原始信號值進行標準化，通過標準化后的信號值計算出每個miRNA在不同樣品間的表達變化，并計算樣品間miRNA表達量變化的統計學顯著性。表達變化倍數≥2，P<0.05的miRNA被挑選出來，為顯著性差異表達的miRNA。參照TakaRa SYBR PrimeScript miRNA RT-PCR Kit說明書，將提取的RNA逆轉錄，將篩查出的差異miRNA進行Real-time PCR反應，由羅氏480Ⅱ熒光定量PCR儀完成。U6作為內參，每個樣品設3個復孔。根據同一個樣本的CT值(目標基因和內參基因)計算△CT值，miRNA表達相對量采用2-△△CT進行計算比較三組的差異表達miRNA及靶基因的表達情況，并比較A組中不同年齡(45歲及>45歲)、分期(Ⅰ～Ⅱ期及Ⅲ～Ⅳ期)、分化程度(高分化、中分化及低分化)及轉移(是與否)情況者的上述差異表達miRNA及靶基因表達情況。

1.3統計學方法 應用SPSS 16.0統計軟件分析數據。計數資料比較采用χ2檢驗，計量資料比較采用t檢驗、單因素方差分析和SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1三組的差異表達miRNA及靶基因的表達情況比較 A組與B組的差異表達miRNA為miR-34、miR-19，A組的miR-19及survivin表達顯著高于B組，miR-34及PTEN表達顯著低于B組，且A組與B組miR-19和survivin表達高于C組，miR-34和PTEN表達低于C組，三組之間的比較結果差異有統計學意義(P<0.001)，見表1。

表1 三組的差異表達miRNA及靶基因的表達情況比較

2.2A組不同年齡者的差異表達miRNA及靶基因的表達情況比較 A組中不同年齡者的miR-34、miR-19、survivin及PTEN表達比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

2.3A組不同分期者的差異表達miRNA及靶基因的表達情況比較 A組中分期較高者的miR-19及survivin表達顯著高于分期較低者，miR-34及PTEN表達則顯著低于分期較低者，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

2.4A組中不同分化程度者的差異表達miRNA及靶基因的表達情況比較 A組中分化程度較低者的miR-19及survivin表達顯著高于分化程度較高者，miR-34及PTEN表達則顯著低于分化程度較高者，不同分化程度患者之間的比較結果差異有統計學意義(P<0.001)，見表4。

2.5A組中不同轉移情況者的差異表達miRNA及靶基因的表達情況比較 A組中存在轉移者的miR-19及survivin表達顯著高于無轉移者，miR-34及PTEN表達則顯著低于無轉移者，差異有統計學意義(P<0.05)，見表5。

表2 A組中不同年齡者的差異表達miRNA及靶基因的表達情況比較

表3 A組中不同分期者的差異表達miRNA及靶基因的表達情況比較

表4 A組中不同分化程度者的差異表達miRNA及靶基因的表達情況比較

表5 A組中不同轉移情況者的差異表達miRNA及靶基因的表達情況比較

3 討 論

宮頸癌作為女性第二大惡性腫瘤，在我國具有較高的發病率，關于本病發生發展的研究眾多。對于本病的研究顯示，高危型HPV感染幾乎是所有宮頸癌發生的必要條件，故高危型HPV感染一直是本病的研究重點[5-6]。研究顯示，HPV16感染與宮頸鱗癌的發生密切相關，而HPV18感染傾向于宮頸腺癌的發生，而宮頸腺癌的淋巴和卵巢轉移率均相對較高[7-8]，且對放化療的敏感性相對較低，因此預后較差，病死率也較高，因此對宮頸腺癌的臨床發病機制等方面的研究意義更高[9-11]。臨床中與宮頸癌相關的miRNA相關研究眾多，且在宮頸癌患者中表達顯著異常的miRNA指標多見，但是用于宮頸癌病理類型鑒別的miRNA指標研究相對不足，同時，HPV18感染對宮頸癌中miRNA表達差異研究，尤其是對不同病理類型宮頸癌的表達差異研究極為匱乏。對本方面的研究有助于了解HPV18感染病理分型及miRNA表達的檢測意義[12-13]，為疾病的診治與防控提供參考依據。

本研究就HPV18在不同病理類型宮頸癌中miRNA表達差異進行探究，結果顯示，HPV18陽性宮頸腺癌患者及HPV18陽性宮頸鱗癌患者的差異表達miRNA為miR-34、miR-19，對上述mRNA及其靶基因的進一步研究顯示，HPV18陽性宮頸腺癌患者的miR-19及survivin顯著高于HPV18陽性宮頸鱗癌患者，miR-34及PTEN顯著低于HPV18陽性宮頸鱗癌患者，且HPV18陽性宮頸腺癌患者與HPV18陽性宮頸鱗癌患者的上述檢測結果顯著異于健康宮頸者，說明miR-19、miR-34、survivin及PTEN在HPV18陽性在不同病理類型宮頸癌中的表達差異顯著，有助于鑒別HPV18陽性宮頸癌患者的病理分型，同時對于HPV18感染導致的miRNA異常表達有一定的反應價值，其通過影響miR-19及miR-34的表達來進一步影響相關靶基因survivin及PTEN等有關[14-16]，survivin及PTEN 作為miR-19及miR-34的作用靶基因，其主要為導致靶基因survivin的過度表達及PTEN的下降缺失，而這可導致細胞周期的阻滯，細胞凋亡抑制情況突出，進而引起癌前病變向宮頸癌的進展，因此在宮頸腺癌的發生發展中起著較大的影響作用[17-19]。另外，對HPV18陽性宮頸腺癌中不同年齡者研究顯示，上述指標表達差異并不顯著，而不同分期、分化程度及轉移情況者的表達差異較為顯著，因此提示miR-19、miR-34、survivin及PTEN表達差異有助于HPV18陽性宮頸腺癌的分期、分化程度及轉移情況鑒別，因此對于HPV18感染的宮頸癌患者應重視上述指標的檢測，同時也為宮頸癌尤其腺癌的基因診斷、靶向藥物治療以及預后評估都提供一定參考價值[20-21]。

綜上所述，miR-19、miR-34、survivin及PTEN在HPV18陽性在不同病理類型宮頸癌中的表達差異顯著，且不同分期、分化程度及轉移情況者的表達情況差異明顯，故臨床檢測與研究意義較高。