低膽固醇牛油的制備及其理化性質分析

劉琳，謝勇，劉越，鄭萬琴，肖德清，劉雄*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715)2(重慶帥克食品有限公司，重慶，402284)

食用牛油是由屠宰分割新鮮、潔凈完好的脂肪組織精煉而成，精煉后的牛油為白色或淺黃色固體，質地均勻細膩，具有特殊的動物油脂風味[1]。牛油因富含維生素、脂肪酸、礦物質等營養物質并具有獨特濃郁的脂肪風味，被廣泛用于烘焙制品、香精香料、調味醬料包等各類食品加工制造領域[2]。

在川渝地區牛油主要用于制作火鍋底料，以牛油火鍋底料煮制的火鍋，色澤光亮，味道濃郁，有著其他油脂無法比擬和替代的優點。由于火鍋底料制作與食用的特殊性，在加工及涮煮過程中需要使用大量牛油。雖然牛油能賦予火鍋獨特的風味，但牛油中膽固醇含量較高，過多攝入會增加動脈粥樣硬化、肥胖、冠心病和高血壓等心血管疾病的發病風險[3-5]。與此同時，隨著經濟的發展，人民消費水平逐漸提高，消費者對于健康飲食的需求越來越高。因此，脫除牛油膽固醇就顯得尤為重要。目前，國內外關于食品膽固醇脫除的主要方法有吸附劑吸附法、蒸餾法、超臨界CO2法、復合電磁波法、溶劑抽提法、中草藥精煉法、氧化酶分解法、β-環糊精包合法等[6]，其中，β-環糊精包合法脫除技術因成本低、安全、可食無毒、簡單可行等優點受到重視，并在豬油、蛋黃、奶制品等方面得到廣泛的應用[7-9]。因此，利用β-環糊精脫除牛油膽固醇具有一定的可靠性。但國內外鮮有關于油脂進行膽固醇處理后其基本性質的研究報道，尤其是食用牛油。任美燕等[10]采用中性Al2O3降低牛油中膽固醇含量且對牛油的基本理化性質影響小；朱巍[11]利用膽固醇氧化酶脫除液化豬油膽固醇后發現試樣中脂肪酸組分基本不變；ALONSO等[12]使用β-環糊精降低牛乳中膽固醇含量，結果顯示β-環糊精能有效脫除牛乳中膽固醇且不影響牛乳脂肪中的脂肪酸和甘油三酯成分。然而，國內外鮮有關于利用β-環糊精脫除牛油膽固醇后其性質變化的研究報道。因此，本實驗首先以膽固醇脫除率為指標，采用β-環糊精包合法脫除牛油膽固醇，并探討添加量、攪拌時間、攪拌溫度對脫除效果的影響，其次，測定了所得低膽固醇牛油的脂肪酸、熱力學特性、流變特性、風味物質等理化性質，為低膽固醇牛油產業化發展提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

純牛油(肖老伍)，重慶市帥克食品有限公司；食品級β-環糊精，華興生物化工有限責任公司；膽固醇標準品(純度≥98%)，索萊寶公司；所有用于色譜的有機溶劑均為色譜純；其余有機溶劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

DSC 4000差示掃描熱儀，美國PerkinElmer公司；UV-2450紫外分光光度計、QP 2030 PLUS 色譜-質譜聯用儀(gas chromatofraphy-mass spectrmetry,GC-MS)，日本島津公司；50/30 μm PDMS/CAR 萃取纖維頭、SPME手動進樣手柄，美國Supelco公司；DHR-1 TA流變儀，美國TA公司；JJ-1數顯恒溫調速電動攪拌器，方科儀器有限公司；離心機，安信實驗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 β-環糊精包合法脫除膽固醇

參照李相昕等[7]的方法并稍作調整。稱取50 g牛油(已融化)于250 mL燒杯中，加入50 g去離子水和不同量的β-環糊精，混合均勻。將混合物置于不同溫度的水浴鍋中，以200 r/min速度攪拌不同時間后取出，在4 000 r/min下離心10 min，水洗3～4次，小心取出上層油脂，干燥后低溫密封避光保存。

1.3.2 理化指標檢測

膽固醇按GB/T 5009.128—2003比色法測定，酸價按GB/T 5009.229—2016冷溶劑指示劑滴定法測定，碘值按GB/T 5532—2008測定，過氧化值按GB/T 5009.227—2016的滴定法測定，熔點按GB/T 12766—2008測定，相對密度按GB/T 5518—2008測定，丙二醛按GB/T 5009.181—2016測定，水分及揮發物按GB/T 5009.236—2016電熱干燥箱法測定。

1.3.3 膽固醇脫除率的計算

取各油樣按照1.3.2的方法測定膽固醇含量，按公式(1)計算膽固醇脫除率：

(1)

式中:W1為牛油膽固醇含量，mg/g;W2為脫除膽固醇后牛油膽固醇含量，mg/g。

1.3.4 GS-MS脂肪酸含量的測定

樣品前處理：參照ZHANG等[13]的方法并稍作修改。準確稱取0.1 g油脂于試管中，加入5 mL正己烷，振蕩5 min使其完全溶解；加入2 mL 0.5 mol/L的KOH-CH3OH溶液，充分搖勻后置于60 ℃水浴鍋中加熱30 min對樣品進行甲酯化，靜置分層1 h，取上清液進行分析，進樣量為1 μL，每個樣品平行測定3次，測定結果取平均值。

色譜條件[14]：DB-5MS毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm);進樣口溫度250 ℃。程序升溫：起始溫度45 ℃; 20 ℃/min升溫至140 ℃，保持2 min;10 ℃/min升溫至180 ℃，保持2 min;2 ℃/min升溫至210 ℃，保持5 min；2 ℃/min升溫至230 ℃，保持8 min；10 ℃/min升溫至250 ℃，保持2 min。載氣He，流速1 mL/min，分流比50∶1。

質譜條件：離子源EI；離子源溫度230 ℃；電子能量70 eV；接口溫度 280 ℃；質量掃描范圍(m/z)：5～500，標準質譜庫NIST08 s.LIB。

數據處理：將樣品質譜圖數據與NIST08 s.LIB質譜數據庫進行檢索對比，再結合MS圖中的特征碎片離子與相關參考文獻即可對相應化合物定性，采用峰面積歸一化法進行定量分析，測得各組分的相對百分含量。

1.3.5 熱力學性質分析

參照LIU等[15]方法并稍作調整。精確稱取樣品7～8 mg放入DSC的專用鋁盒中密封好，同時以密封的空白鋁盒作為對照。具體溫度變化程序為：常溫下以5 ℃/min 快速升溫至80 ℃，維持10 min以消除結晶熱歷史，然后以5 ℃/min 降溫至-30 ℃，并維持10 min，使樣品充分結晶，再以5 ℃/min升溫至80 ℃，N2流量為20 mL/min，記錄DSC熔化曲線與結晶曲線，并利用儀器自帶軟件進行計算處理。

1.3.6 流變學特性分析

參照王振杰等[16]方法并稍作修改。采用TA流變儀測定牛油的流變學特性。選擇40.00 mm的平行板夾具，測試模式為Flow Ramp，測試間距為500 μm，剪切速率0.10～1 000.00 s-1，平衡時間為120 s；每次測量前需校正儀器；加樣時必須保持樣品的一致性與均勻性，避免擠壓出現氣泡；當轉至修邊高度時，小心移除多余的試樣，從而避免邊際效應干擾。在采集數據時，分別測定50、100 ℃操作臺條件下的流變特性數據。

1.3.7 揮發性物質的測定

固相微萃取條件[17-18]：準確稱取2.50 g樣品置于20 mL頂空進樣瓶中，用聚四氟乙烯隔墊密封，65 ℃下平衡10 min，通過隔墊將已老化(溫度250 ℃、時間15 min)的75 μm PDMS/CAR固相微萃取頭插入頂空瓶中距離液面1 cm處，吸附30 min，待GC-MS分析。

氣相條件：DB-5MS毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；進樣口溫度250 ℃。程序升溫：起始溫度40 ℃，保持3 min；5 ℃/min升溫至60 ℃，保持1 min；2 ℃/min升溫至100 ℃，保持1 min；4 ℃/min 升溫至160 ℃，保持1 min；10 ℃/min升溫至250 ℃，保持1 min。載氣He，流速1.0 mL/min，不分流進樣。

質譜條件：離子源EI；離子源溫度230 ℃；電子能量70 eV；接口溫度250 ℃；質量掃描范圍(m/z)：50～550。

數據處理：結合NIST08 s.LIB質譜數據庫進行檢索對比定性，采用峰面積歸一化法進行定量分析，測得揮發性物質各組分的相對百分含量。

關鍵風味物質確定[19]：采用相對氣味活度值(relative odor activity value，ROAV)法分析各揮發性物質對牛油風味的貢獻。定義對樣品風味貢獻最大的風味物質 ROAVstan=100，對其他風味物質相對氣味活度值計算如公式(2)所示：

(2)

式中：CA，各揮發性風味物質的相對含量，%；TA，各揮發性風味物質的感覺閾值，μg/kg；Cmax，對總體風味貢獻最大的揮發性風味物質的相對含量，%；Tmax，對總體風味貢獻最大的揮發性風味物質的感覺閾值，μg/kg。ROAV≥1的組分為所分析樣品的關鍵風味化合物，0.1≤ROAV<1的組分對樣品的總體風味具有重要的修飾作用。

1.3.8 數據處理

采用SPSS 19.0統計軟件和Excel軟件進行方差分析和數據分析。

2 結果與分析

2.1 β-環糊精脫除牛油中膽固醇條件的優化

2.1.1 β-環糊精脫除牛油中膽固醇條件的優化

β-環糊精添加量、作用時間、作用溫度對膽固醇脫除率的影響結果如圖1所示，當攪拌溫度為60 ℃，攪拌時間為1.5 h時，隨著β-環糊精添加量的增大膽固醇脫除率先升高后降低，當添加量為3%(質量分數)時，膽固醇脫除率最高，當添加量超過3%時，膽固醇脫除率有緩慢下降的趨勢。原因可能是β-環糊精可借助內腔疏水外圍親水的結構與非極性疏水化合物膽固醇形成包合物[7]，隨著添加量增大，可包合膽固醇的分子增多，脫除率升高；但添加量過多，會導致體系黏度增加流動性減弱，增加β-環糊精與膽固醇分子間競爭，從而β-環糊精包合膽固醇分子的能力降低，膽固醇脫除率有所下降。當β-環糊精添加量為3%，攪拌溫度為60 ℃時，膽固醇脫除率隨著時間的延長先升高后降低，出現該現象可能是因為適當的攪拌時間會增加膽固醇與β-環糊精接觸的機會，增大形成包合物的可能性，而長時間攪拌產生的剪切作用力會在一定程度上破壞已形成包合物的結構，釋放出膽固醇分子[20]，從而脫除率下降，因此延長攪拌時間不利于提高膽固醇脫除率。在β-環糊精添加量為3%、攪拌時間為1.5 h時，隨著溫度的升高，脫除率先增加后下降，溫度為45 ℃時，脫除率最高。這可能是溫度過低導致牛油部分凝固，其體系黏度較大流動性差，減少了β-環糊精與膽固醇接觸的機率，而溫度升高流動性較好可增加接觸機會形成包合物，但溫度過高會影響包合物的穩定性，從而影響膽固醇脫除效果[21]。

圖1 β-環糊精添加量、作用時間、作用溫度對膽固醇脫除效果的影響Fig.1 Effect of β-cyclodextrin addition,adsorption time,adsorption temperature on the removal rate of cholesterol

2.1.2 β-環糊精脫除牛油中膽固醇最佳條件的選擇

在單因素試驗的基礎上進行正交實驗，對β-環糊精脫除牛油膽固醇工藝參數進行優化，結果見表1。由表1中的R值可知，影響牛油膽固醇脫除率因素的主次關系依次為C>A>B，即β-環糊精添加量對膽固醇脫除效果影響遠大于作用時間與溫度；最優組合A3B1C2在正交試驗中未出現，不能確定此組合是否為最佳工藝，因此需要進行驗證試驗，在A3B1C2條件下進行平行實驗，得到平均脫除率為(47.23±1.83)%，高于其他組的脫除率，說明β-環糊精添加量3%、攪拌時間1.5 h、攪拌溫度45 ℃為相對最佳工藝。

2.2 膽固醇脫除前后牛油理化指標比較

牛油脫除膽固醇前后基本理化指標如表2所示，使用β-環糊精可明顯降低牛油中膽固醇含量，處理后的牛油氣味、組織狀態、碘值、酸價、熔點與相對密度基本保持不變，水分含量增加可能與膽固醇脫除時加入水和水洗過程有關，過氧化值的增大可能是膽固醇脫除過程中加熱油脂發生氧化所致。根據GB 10146—2015的規定，處理后牛油的基本理化指標與感官品質均符合國標規定，因此采用β-環糊精脫除膽固醇對牛油基本理化性質影響較小。

表1 β-環糊精脫除牛油中膽固醇工藝正交試驗設計及結果Table 1 Orthogonal array design and results of β-cyclodextrin removal of cholesterol from beef tallow

2.3 GS-MS脂肪酸含量分析

牛油與低膽固醇牛油主要脂肪酸組成及相對含量變化見表3，由表3可知，牛油主要由油酸(C18∶1)、硬脂酸(C18∶0)、棕櫚酸(C16∶0)3種脂肪酸組成，其中飽和脂肪酸含量較高占總量50%以上。脫除膽固醇后的牛油與未經處理牛油相比組分基本不變，這可能與β-環糊精特殊外圍親水內腔疏水的環狀結構有關，該環狀結構對非極性分子(如膽固醇)結合能力較強恰好可以使膽固醇進入，并能利用其疏水性質與膽固醇形成穩定的包合物并通過離心水洗方式除去而不影響主要脂肪酸組分變化[7]，這與ALONSO等利用β-環糊精脫除牛乳中膽固醇后脂肪酸與甘油三酯不變的研究相似[12]。而主要脂肪酸相對含量發生較小變化可能與脫除膽固醇過程中的處理溫度和處理時間變化有關，王振杰等[16]在探究調和油時發現，油脂脂肪酸變化與處理時間、處理溫度、熱處理方式密切相關。一般在高溫條件下，油脂因氧化、環化和異構化反應會生成小分子醛、酮、酸、環狀物和異構體等物質[22]，但本實驗處理溫度較低，所以對油脂影響較小。

表2 牛油與低膽固醇牛油理化指標Table 2 Physical and chemical parameters of tallow and low cholesterol tallow

表3 牛油與低膽固醇牛油主要脂肪酸的組成及相對含量Table 3 Composition and relative content of main fatty acids in tallow and low cholesterol tallow

2.4 熱力學性質分析

差示掃描量熱法(different scanning calorimeter,DSC)是油脂研究中最常用的熱分析技術，采用DSC能有效反映油脂在程序升溫、降溫及恒溫條件下發生物理變化(結晶、熔化、晶型轉變等)或化學變化時的吸熱和放熱現象，從而推測油脂的物理和化學特性[23]。

圖2、圖3分別為牛油與低膽固醇牛油的熔化與結晶曲線，它們相應的轉變溫度見表4。由圖2～圖3和表4可以看出，2個樣品油脂熔化與結晶曲線峰形相似且出峰溫度相近，CHIAVARO等[24]研究表明，不同油脂吸熱峰和放熱峰的不同，是由其脂肪酸的組成、鏈長、飽和度與不飽和度等不同而引起的，在脂肪酸含量測定中已表明2種油脂的脂肪酸種類與含量無明顯變化，所以這2種油脂熔化與結晶曲線相似。在結晶過程中2個樣品油脂均有2個吸熱峰，出峰時間與峰形差別不大，均表現第1個高溫放熱峰面積小于最后一個低溫放熱峰面積，這是因為結晶過程中高熔點的組分先析出，相互聚集后形成晶體，隨著溫度不斷降低，過冷度增大，大量低熔點組分迅速結晶，故出現較大放熱峰，結晶峰變寬[25]。在熔化過程中2個樣品油脂均有3個吸熱峰，峰1、峰2熔融峰較窄，峰面積小，峰3熔融峰較寬，峰面積大。通常尖峰意味著構成晶體的甘油三酯組分比較單一，成核時間基本相同；而寬峰意味著晶體中有多種類型的晶核，峰形狀的變化則對應著同質多晶的改變[1]。不同油脂特征性的脂肪酸與甘油三酯差異會顯著影響其結晶和熔化特性，因此可以推測牛油進行膽固醇處理后不影響其甘油三酯組分與晶型變化。

圖2 牛油及低膽固醇牛油DSC熔化圖譜Fig.2 DSC melting profiles of tallow and low cholesterol tallow

圖3 牛油及低膽固醇牛油DSC結晶圖譜Fig.3 DSC crystallization profiles of tallow and low cholesterol tallow

表4 牛油、低膽固醇牛油結晶-熔化過程中DSC峰值溫度比較Table 4 Comparison of DSC transition temperatures for melting and crystallisation curves of tallow and low cholesterol tallow

2.5 流變學特性分析

不同的油脂具有各自獨有的特性，油脂的流變學性質可以用來表征其外觀、結構、硬度、黏度等特性，這些特性為了解油脂內部結構、產品配方設計、質量控制及工藝設計提供了重要依據[26]。本研究主要通過測定2種油脂在50、100 ℃下剪切速率與黏度關系分析比較其流變學行為變化。

圖4、圖5為牛油與低膽固醇牛油在50、100 ℃條件下黏度隨剪切速率變化的關系圖。由圖4、圖5可知，在相同條件下，2種油脂表現出一致的流體行為，在剪切速率0～100 s-1表現出明顯的剪切稀化的非牛頓流體的流變行為，隨著剪切速率的增大，其流體黏度逐漸減小并趨于穩定，這主要是因為剪切速率的提高有利于油脂形成一種更加穩定且均勻的流體結構狀態[27]；在剪切速率一定時，油脂在50 ℃時的黏度大于100 ℃的黏度，這是因為隨著溫度的增加，油脂內部分子的熱運動加劇，從而增加了分子之間的流動性，導致分子之間的作用力減小，樣品黏度降低[28]，王振杰等[16]研究溫度對調和油黏度影響時也有相似結論。此外，2種油脂在相同條件下的黏度無顯著性差異，可能是油脂黏度由脂肪酸的鏈長和不飽和度所決定[26]，在脂肪酸測定結果中已表明2種油脂主要脂肪酸差異較小；此外，還可以看出低膽固醇牛油黏度略小于牛油，這樣有利于燙煮食材時減少油脂附著，從而減少油脂攝入量。

圖4 牛油與低膽固醇牛油的黏度隨剪切速率變化曲線(50 ℃)Fig.4 Shear rate-viscosity curve of tallow and low cholesterol tallow at 50 ℃

圖5 牛油與低膽固醇牛油的黏度隨剪切速率變化曲線(100 ℃)Fig.5 Shear rate-viscosity curve of tallow and low cholesterol tallow at 100 ℃

2.6 揮發性物質分析

采用頂空固相微萃取-氣質聯用技術萃取和分離鑒定牛油與低膽固醇牛油的揮發性風味物質成分，并通過風味物質ROAV值分析脫除牛油膽固醇后主要風味物質變化情況。

由表5可知,牛油與低膽固醇牛油的揮發性物質主要由烴類、醇類、醛類、酮類與酯類化合物構成，其中牛油與低膽固醇牛油分別測得87、84種揮發性物質，低膽固醇牛油中某些揮發性物質的消失與生成可能與β-環糊精的吸附作用和油脂水洗加熱過程有關，但2種油脂揮發性物質種類相差不大，說明使用β-環糊精脫除牛油膽固醇不會對牛油的風味物質種類造成較大影響。牛油中烴類物質較多，其次是醛類、醇類和酯類化合物，而酸類和酮類較少。

烷烴類主要來源于脂肪酸烷氧自由基的斷裂[35]，本實驗檢測出的烷烴類主要為萜烯烴、支鏈烷烴與一系列正構烷烴。雖然烴類物質閾值較高，氣味較淡或者無氣味，對整體風味貢獻較小，但在風味研究中認為其具有不可忽視的基底作用[36]，如石竹烯等萜烯烴廣泛存在于植物體內的，具有較強香氣和生理活性[35]。來自樣品中脂肪氧化分解的大部分醇類化合物具有令人愉快的香氣，特別是不飽和醇類物質閾值較低，對風味貢獻較大[37]，本實驗檢測出的反-2-甲基環已醇、異蒲勒醇和1-辛烯-3-醇均為不飽和醇，其中異蒲勒醇呈樟腦和薄荷香氣，1-辛烯-3-醇呈蘑菇香，均對牛油風味形成產生一定作用。脂肪酸氧化降解產生的醛類物質是2種牛油樣品中最重要的揮發性風味物質[37]，實驗檢測出的醛類物質從成分上看主要為直鏈飽和醛(如癸醛、十一醛等)和烯醛(如(E)-2-庚烯醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛、(E)-2-辛烯醛等)，其中(E)-2-庚烯醛含量最高呈脂肪香味。一般認為酮類物質具有清香氣味、奶油味或果香味，其主要來自醇的氧化產物或者酯類分解的產物[37]。含量最高的2-壬酮也為油脂提供水果、花、油脂和藥草似香氣。而可能由醇類和酸類化合物酯化生成的酯類物質可以使產品呈現果香與脂肪香[29]。如乙酸二氫戊酯呈花香、清香和豆香。

表5 牛油、低膽固醇牛油的中的揮發性物質種類及相對含量Table 5 Types and relative contents of volatile substances in tallow and low cholesterol tallow

續表5

由表6可知，(E,E)-2,4-庚二烯醛對2種油脂的貢獻最大，定義(E,E)-2,4-庚二烯醛的ROAV為100，并計算其他揮發性風味化合物的ROAV，ROAV越大的組分對樣品總體風味的貢獻也越大，一般認為ROAV≥1的物質為所分析樣品的關鍵風味成分，0.1≤ROAV≤1，該物質則對樣品總體風味具有重要修飾作用，ROAV<0.1的組分為潛在風味物質[24]。由表5可知，醛類物質對牛油的整體風味貢獻最大，其余類別風味物質貢獻相對較小。2種牛油共有的關鍵風味物質有(E,E)-2,4-庚二烯醛、1-辛烯-3-醇、(E)-2-辛烯醛、癸醛、(E)-2-癸烯醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛，其中(E,E)-2,4-庚二烯醛對兩者風味貢獻最大，芳樟醇、十二醛對總體風味具有重要的修飾作用，而正辛醛是牛油中獨有的風味物質，十一烷、十二烷、十四烷因為相對含量低且感覺閾值高，對牛油的風味貢獻很小。

總體上看，使用β-環糊精脫除牛油膽固醇，其揮發性風味化合物種類與相對含量變化較小，關鍵風味物質種類不變，且處理后的油脂保留了獨特的風味。

表6 牛油與低膽固醇牛油揮發性風味物質ROAV值Table 6 ROAV of volatile substances of tallow and low cholesterol tallow

3 結論

本實驗使用β-環糊精包合制備低膽固醇牛油，并對其基本理化性質進行測定分析，得到如下結論：

(1)最優工藝為β-環糊精添加量3%(質量分數)、攪拌時間1.5 h、攪拌溫度45 ℃，此條件下牛油中膽固醇脫除率可達到(47±1.83)%，其中β-環糊精添加量對脫除效果影響最大。

(2)與未處理的牛油相比，低膽固醇牛油基本理化指標符合國標規定；主要脂肪酸種類與含量變化較小；熔化與結晶曲線峰形相似且出峰溫度接近；在相同條件下黏度略低，更利于減少油脂附著從而降低油脂攝入量；揮發性風味化合物種類與相對含量變化較小，關鍵風味物質種類基本不變，處理后的牛油仍具有牛油的獨特風味。

對脫除膽固醇后的牛油理化性質進行分析，可為健康牛油系列產品的開發提供理論基礎。但本試驗尚未進行放大試驗，需要進一步深入研究。