蜂膠中提取的咖啡酸苯乙酯和咖啡酸芐酯抑制食管癌Eca109細胞的功效

劉 會，袁雯雯，李俊雅，玄紅專

聊城大學生命科學學院，聊城 252059

蜂膠是蜜蜂采集植物樹脂并混入其上顎腺、蠟腺的分泌物加工而成的一種具有芳香氣味的膠狀固體物[1]。由于植物來源不同，蜂膠的化學成分非常復雜。世界不同地區的蜂膠大致分為七類，分別是：“楊樹型”蜂膠、“樺樹型”蜂膠、巴西綠膠、紅膠、太平洋蜂膠、地中海蜂膠以及“克魯西屬”蜂膠[2]。中國蜂膠屬于楊樹型蜂膠并且其主要的化學組分是黃酮類及酚酸類。到目前為止，已有600種以上的成分從蜂膠中鑒定出來[3]。現代藥理學研究表明，蜂膠具有抑菌[4]、抗炎[5,6]、抗病毒[7]、抗腫瘤[8]、抗氧化[9]及免疫調節[10,11]等功效。

研究表明蜂膠對多種不同腫瘤細胞具有較好的抑制功效[12-14]，特別是蜂膠中短葉松素、咖啡酸芐酯(CABE)、咖啡酸苯乙酯(CAPE)、芹菜素、松屬素、白楊素和高良姜素等[15]。食管癌是一種嚴重的惡性腫瘤，嚴重威脅人類的身體健康。由于食管癌細胞高度浸潤和轉移，使得該疾病的治療和預后效果都較差[16,17]。從天然產物中發掘抑制食管癌的藥物也是食管癌治療的一個重要方向。CAPE和CABE是蜂膠中的兩種重要酯類，但它們對食管癌的影響還未見報道。本研究重點研究了CAPE和CABE對食管癌Eca109細胞的抑制功效及作用機理，為蜂膠應用于食管癌的治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

中國蜂膠產自山東省(購于蜂農)，主要膠源植物為楊樹。主要試劑包括：DMEM培養基(美國Gibco公司)；胎牛血清(美國Hyclone公司)；胰酶、磺酰羅丹明B(SRB)、Hoechst 33258、活性氧檢測熒光探針2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)和線粒體膜電位熒光探針JC-1(美國Sigma公司)；Matrigel膠和Transwell孔板(美國Corning公司)、DAPI染料(美國Genview公司)、抗體Caspase-3、PARP(美國Cell Signaling Technology)、β-actin (美國Santa Cruz Biotechnology)、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；其它試劑均為分析純。

Eca109細胞由本實驗室保存。

1.2 試驗儀器

Heal Force生物安全柜、Heal Force CO2培養箱(力康生物醫療科技控股有限公司)；TE2000S 倒置熒光顯微鏡(日本Nikon公司)；激光掃描共聚焦顯微鏡(Olympus)；電泳儀和電轉儀(Bio-Rad公司)；MK3酶標儀(芬蘭雷勃公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 CAPE和CABE的制備方法

CAPE和CABE的制備方法根據參考文獻[18,19]。首先將中國蜂膠冷凍，粉碎，用熱水浸提，過濾，濾液減壓濃縮。然后向濃縮液中加入95%乙醇至乙醇含量為70%左右，靜置過夜，取上清液濃縮得浸膏。再用大孔吸附樹脂粗分離，再依次用0%、20%、40%、60%、80%、95%乙醇-水溶液為流動相梯度洗脫，分別收集洗脫部分，濃縮，得粗分樣品。將粗分樣品用半制備型高效液相色譜進行分離純化，色譜柱為C18SMB 100柱(400 mm×25.4 mm，10 μm)，流動相為甲醇-水，檢測波長為280 nm，根據采集到的色譜圖手動收集各個目標組分餾分，將得到的餾分減壓濃縮。對于高純度的餾分，其化學結構經核磁共振、X射線單晶衍射等手段進行鑒定，得到CAPE和CABE。

1.3.2 細胞培養

食管癌Eca109細胞培養在添加10%胎牛血清的DMEM培養基中，孵育條件為：5% CO2、37 ℃、飽和濕度CO2培養箱中。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態。

1.3.3 細胞存活率的測定

將處于對數生長期的細胞按4 000個/孔種植到96孔板，24 h后，除正常組外，處理組細胞分別經CAPE(80 μM)和CABE(80 μM)處理后，棄細胞培養液，用10%三氯乙酸4 ℃固定1 h，然后用SRB染色10 min，晾干，100 mmol/L Tris堿溶解，在492 nm處測吸光值。

細胞存活率=(處理組OD值/對照組OD值)

×100%

1.3.4 DAPI染色

DAPI 染色主要用于觀察細胞核的形態，在48 h，所有細胞用300 nM DAPI染液室溫孵育5 min，細胞經1×PBS輕輕漂洗2～3次，然后在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察細胞核的形態并拍照。

1.3.5 LDH分析

在48 h收集對照組和處理組細胞培養液，離心。上清液中的LDH含量按照試劑盒的操作進行測定。

1.3.6 細胞浸潤實驗

取對數生長期的Eca109細胞，消化，調整細胞密度到5×105個/mL，Transwell上室加入200 μL細胞懸液，下室中加入750 μL含20%胎牛血清的DMEM培養液，37 ℃孵育48 h。用濕棉簽擦掉上室上面的Matrigel和非侵襲細胞，上室下面用95%酒精室溫固定10 min，然后用0.1%結晶紫繼續固定染色15 min，高倍鏡下計數穿過微孔膜的細胞數。直徑上取4個視野，求其平均值。

1.3.7 細胞遷移實驗

在24孔板中，當細胞密度達到80%時，用10 μL白槍尖垂直在細胞表面劃線，然后用1×PBS輕輕沖洗掉細胞碎片。按照實驗分組，細胞分別經CAPE(80 μM)及CABE(80 μM)處理48 h，每12 h在倒置相差顯微鏡下觀察、拍照細胞遷移情況。用Image-Pro Plus軟件計算細胞遷移率。

1.3.8 活性氧(ROS)水平的檢測

將處于對數生長期的Eca109細胞按4×104個/mL種植到共聚焦小皿中。待細胞長到60%以上，除正常組外，處理組細胞分別經CAPE(80 μM)及CABE(80 μM)處理24 h。棄細胞培養液，用1×PBS清洗1次，加DCFH-DA應用液1 mL，37 ℃孵育30 min。棄DCFH-DA應用液，用1 ×PBS漂洗3次，每次5 min，在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.9 線粒體膜電位檢測

將處于對數生長期的Eca109細胞按4×104個/mL種植到共聚焦小皿中。待細胞長到60%以上，除正常組外，處理組細胞分別經CAPE(80 μM)及CABE(80 μM)處理24 h。棄細胞培養液。用1 ×PBS清洗，加JC-1染色液500 μL，37 ℃孵育20 min。棄JC-1染色液，用1×PBS漂洗3次，每次5 min，在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.10 細胞蛋白提取及蛋白質免疫印跡

CAPE(80 μM)及CABE(80 μM)分別處理細胞后收集各組細胞，在RIPA裂解液中冰上裂解30 min，BCA法測定總蛋白濃度。取30～40 μg總蛋白提取物上樣，經12%SDS-PAGE凝膠電泳后，轉移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，然后加入Caspase 3、PARP和β-actin一抗稀釋液(1∶1 000)于4℃冰箱孵育過夜。用1×PBST洗膜三次，每次5 min；再加入二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h，1×PBST洗膜三次，每次5 min，然后ECL顯色。Quantity One進行蛋白定量分析。

1.4 數據統計

圖1 蜂膠中11種組分對Eca109細胞增殖的影響Fig.1 The effects of 11 constituents extracted from propolis on Eca109 cells注：a：咖啡酸；b：阿魏酸；c：異阿魏酸；d：3,4-二甲氧基肉桂酸；e：短葉松素；f：CABE；g：CAPE；h：芹菜素；i：松屬素；j：白楊素；k：高良姜素。與空白對照組比較，*P<0.05；**P<0.01。下同。Note:a:Caffeic acid;b:Ferulic acid;c:Isoferulic acid;d:3,4-dimethoxycinnamic acid;e:Pinobanksin;f:CABE;g:CAPE;h:Apigenin;i:Pinocembrin;j:Chrysin;k:Galangin.Compared with control,*P<0.05;**P<0.01.The same below.

2 結果

2.1 蜂膠中11種組分對Eca109細胞增殖的影響

前期我們從蜂膠中分離出11種組分，分別是咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸、3，4-二甲氧基肉桂酸、短葉松素、CABE、CAPE、芹菜素、松屬素、白楊素和高良姜素。首先檢測了這11種組分對食管癌Eca109細胞增殖的影響。結果見圖1。由圖1可以看出，咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸、3，4-二甲氧基肉桂酸對Eca109細胞的增殖沒有顯著的影響。CABE和CAPE顯著抑制食管癌Eca109細胞的增殖(**P<0.01，*P<0.05)。

2.2 CAPE和CABE抑制Eca109細胞增殖并誘導其凋亡

通過初步篩選可以看出CAPE和CABE顯著抑制Eca109細胞增殖，接下來我們詳細研究了CAPE和CABE在不同時間和不同濃度條件下對Eca109細胞的影響，結果發現在80 μM時，CAPE和CABE隨著時間的延長顯著抑制Eca109細胞的增殖，且CAPE的效果優于CABE(圖2A)(**P<0.01，*P<0.05)；在20～160 μM時隨著濃度的增加CAPE和CABE顯著抑制Eca109細胞的增殖，且CAPE效果優于CABE(圖2B)(*P<0.05)；通過DAPI染色發現CAPE和CABE(80 μM)顯著引起細胞核的斷裂和濃縮(圖3C)；LDH的檢測發現，CAPE(20～80 μM)和CABE(20～160 μM)對LDH的釋放沒有顯著影響，但CAPE在160 μM時，LDH釋放顯著升高，說明高濃度的CAPE可能引起Eca109細胞的壞死(圖2D)。

圖2 CAPE和CABE抑制Eca109細胞增殖并誘導其凋亡Fig.2 CAPE and CABE inhibited proliferation and induced apoptosis in Eca 109 cells注：A：80 μM CAPE和CABE處理Eca109細胞0、3、6、12、24和48 h后細胞存活率；B：不同濃度CAPE和CABE處理Eca109 48 h后細胞存活率；C：DAPI染色(200×)；D：CAPE和CABE處理對Eca109細胞中LDH的影響。Note:A:Eca109 cells were treated with 80 μM CAPE and CABE for 0,3,6,12,24 and 48 h;B:Cell viability of Eca109 48 h after treatment with different concentrations of CAPE and CABE;C:DAPI staining (200×);D:Effects of CAPE and CABE treatment on LDH in Eca109 cells.

2.3 CAPE和CABE抑制Eca109細胞遷移和浸潤

如圖3所示，隨著時間的延長，與對照組相比CAPE和CABE(80 μM)顯著抑制 Eca-109細胞的遷移和浸潤(**P<0.01)，并且CAPE(80 μM)對Eca109的抑制遷移功效要好于CABE。

2.4 CAPE和CABE上調Eca109 細胞中Caspase 3和PARP水平

接下來，我們檢測了CAPE和CABE對Eca109細胞中凋亡執行者Caspase 3和PARP水平的影響。結果可以看出，CAPE 和CABE(80 μM)顯著上調了Caspase 3和PARP的水平(**P<0.01，*P<0.05)，表明CAPE和CABE誘導Eca109細胞凋亡，而且隨著濃度和時間的延長，CAPE和CABE誘導凋亡更顯著(圖4)。

圖3 CAPE和CABE抑制Eca109細胞遷移和浸潤Fig.3 CAPE and CABE significantly suppressed the migration and invasion of Eca109 cells注：A：CAPE和CABE對Eca109細胞浸潤的影響；B：CAPE和CABE對Eca109細胞遷移的影響；C：CAPE和CABE對細胞遷移影響的量化圖。Note:A:Effects of CAPE and CABE on Eca109 cell infiltration;B:Effects of CAPE and CABE on migration of Eca109 cells;C:Quantification of the effects of CAPE and CABE on cell migration.

2.5 CAPE和CABE 抑制Eca109細胞中Procaspase 9和Bcl-2的水平

進一步檢測了CAPE和CABE處理Eca109 細胞24 h后對細胞中Caspase 9、Bcl-2和BAX的影響。結果發現，CAPE和CABE顯著抑制Bcl-2蛋白的表達和Procaspase 9的水平(**P<0.01，*P<0.05)，而且CAPE的效果要好于CABE。CAPE和CABE對Eca109細胞中Bax的蛋白表達具有抑制趨勢。

圖4 CAPE和CABE 上調Eca109細胞中Caspase 3和PARP的水平Fig.4 CAPE and CABE obviously upregulated the levels of Caspase 3 and PARP in Eca109 cells注：A和D：Eca109細胞經CAPE和CABE處理后PARP、Procaspase 3、Caspase 3和β-actin蛋白表達；B、C、E、F：PARP、Caspase 3蛋白量化圖。Note:A and D:Expression of PARP,Procaspase 3,Caspase 3 and β-actin in Eca109 cells treated with CAPE and CABE;B,C,E and F:Quantification of relative protein expression quantity of PARP,Caspase 3.

圖5 CAPE和CABE 抑制Eca109細胞中procaspase 9和Bcl-2的水平Fig.5 CAPE and CABE obviously down-regulated the levels of procaspase 9 and Bcl-2 in Eca109 cells注：A：Eca109細胞經CAPE和CABE處理24 h后procaspase 9、BAX、Bcl-2和β-actin蛋白表達；B,C和D：procaspase 9、BAX和Bcl-2蛋白量化圖；E：Bcl-2和BAX的比值。Note:A:Expression of procaspase 9,BAX,Bcl-2 and β-actin in Eca109 cells treated with CAPE and CABE at 24 h.B,C and D:Quantification of relative protein expression quantity of procaspase 9,BAX and Bcl-2;E:The ratio of Bcl-2 to BAX.

2.6 CAPE和CABE上調ROS水平并降低線粒體膜電位

CAPE 和CABE (80 μM) 顯著上調Eca109細胞中的ROS水平，同時CAPE和CABE也顯著降低細胞內線粒體膜電位水平(圖6)。

3 討論與結論

我們前期研究了蜂膠及其主要組分對人乳腺癌細胞(MCF-7和MDA-MB-231)、肺癌細胞(A549)、宮頸癌細胞(HeLa)、膠質瘤細胞(U87、U172)以及人肝癌細胞的抗腫瘤活性[18-20]。本實驗首次研究了蜂膠中11種主要組分對人食管癌細胞Eca109的毒性，發現CAPE和CABE對人食管癌細胞具有較好的抑制的功效，而且在有效的抑制腫瘤細胞增殖的濃度范圍內不會引起細胞的壞死，表明蜂膠中的這兩種酯類化合物在治療和預防食管癌方面具有潛在的應用價值。

圖6 CAPE和CABE 上調Eca109細胞中ROS水平并降低線粒體膜電位Fig.6 CAPE and CABE obviously increased the levels of ROS and decreased mitochondrial membrane potential level in Eca109 cells注：A：CAPE和CABE對ROS影響及量化圖；B和C：CAPE和CABE對線粒體膜電位的影響及量化圖。Note:A:Quantification of CAPE and CABE on the levels of ROS;B and C:Effects of CAPE and CABE on mitochondrial membrane potential and quantification diagram.

活性氧(ROS)主要包括超氧陰離子、氫氧自由基和過氧化氫等。高水平的ROS對細胞產生顯著的損傷效應，可導致DNA損傷、蛋白質氧化以及脂質功能紊亂，從而引起細胞代謝、功能異常。大量研究表明，ROS可以作為第二信使參與包括凋亡在內的細胞代謝調控，在細胞內信號轉導通路中發揮重要作用。而且ROS與癌細胞的異常增殖、轉移和侵襲過程密切相關。本研究表明，CAPE和CABE處理引起Eca109細胞中ROS水平顯著上調，并且促凋亡蛋白顯著上調，抑凋亡蛋白顯著下降，同時腫瘤細胞的增殖、遷移和浸潤都受到顯著抑制。據此，推測CAPE和CABE主要是通過ROS介導的線粒體內源性途徑促進腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞增殖和遷移。

食管癌是常見的消化道腫瘤，是一種食管上皮組織的惡性腫瘤，我國是世界上食管癌高發地區之一。蜂膠是一種重要的天然產物，對多種腫瘤細胞具有抑制功效。本研究進一步證實蜂膠中的CAPE和CABE是兩種重要的抑制食管癌細胞增殖的天然產物。相比較于CABE， CAPE的研究非常多，其藥理學活性研究的非常深入[20]。CABE的研究相對較少，但通過本實驗研究發現，CABE也是一種重要的抑制食管癌細胞增殖、轉移、浸潤并誘導其凋亡的重要化合物，今后還需要進一步深入研究CABE的藥理學活性和作用機理。

總之，盡管CAPE和CABE化學結構非常相似，但其對食管癌Eca109的抑制活性還是有差異，CAPE比CABE顯示出更好地促進食管癌細胞凋亡的活性。CAPE和CABE抑制食管癌Eca109細胞增殖主要是通過線粒體介導的內源性途徑促進腫瘤細胞凋亡。CAPE和CABE是潛在的治療食管癌的化合物，值得深入研究。