逸心湯對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用研究

辛福順，吳埼淇，張 韜，林敏瑜，林紹彬

近年來，隨著溶栓療法、經皮冠狀動脈介入術、冠狀動脈旁路移植術等的廣泛應用，使心肌細胞缺血后重新得到血液灌注。多數情況下，心肌缺血經再灌注后功能可得到恢復，但有時心肌功能不僅不能恢復，反而出現比灌注前更嚴重的損傷和功能障礙，主要表現為舒縮功能降低、再灌注心律失常、心肌能量代謝障礙、超微結構變化及血管無復流等現象，甚至出現永久性傷殘或死亡。這種在缺血基礎上恢復血流后，心肌組織損傷反而加重的現象稱為心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)。心肌缺血是多因素、多基因共同參與的復雜過程，盡管臨床實踐表明西藥治療心肌缺血的近期療效尚可，但其遠期療效不甚理想。近年來，大量的研究結果表明，中藥對心血管疾病具有積極的療效。前期臨床研究顯示，逸心湯治療慢性心力衰竭及穩定型心絞痛取得良好的臨床療效，本研究通過構建大鼠MIRI模型，從氧化應激及細胞凋亡角度探討逸心湯對MIRI的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 30只成年雄性SD大鼠，清潔級，體質量(250±20)g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，合格證號：SCXK(滬)2017-0005。

1.2 實驗材料 石蠟(Sigma)，DAB試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)，中性樹膠(Sigma)、Tunel試劑盒(KGA704南京凱基生物科技發展有限公司)，內源性親和素-生物素封閉試劑盒(北京雷根生物技有限公司)，丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，活性氧(ROS)酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司)。

1.3 實驗藥物 逸心湯由丹參、瓜蔞、半夏、薤白、桃仁、紅花、茯苓、黃芪等 12 味藥物組成。由本實驗中心動物技術員以每包逸心湯統一加水120 mL，煎煮30 min至沸騰，共計煎煮5包，湯藥560 mL，1 h后按每只4 mL、每日1劑經胃管注入。

1.4 主要實驗儀器 小動物麻醉呼吸機(深圳瑞沃德生命科技有限公司)；Powerlab數據采集分析系統(澳大利亞埃德公司)；臺式高速冷凍離心機(湘儀)，型號：H1650R；多功能酶標分析儀(匯松)，型號：MB-530；紫外分光光度計(天普)，型號：752；切片機(浙江金華益迪試驗器材)，型號YD-315；包埋機(常州中威電子儀器)，型號BMJ-A；顯微鏡(Motic)，型號：BA210T。

1.5 實驗方法

1.5.1 大鼠MIRI模型制備 大鼠誘導吸入異氟烷，維持麻醉狀態，仰臥位固定，經喉氣管插管，接入小動物呼吸麻醉機，進氣量按100 g進氣1～1.5 mL，呼吸頻率為90～100次/min。將針刺電極插入大鼠左下肢、右上肢皮下，通過Powerlab生理記錄儀記錄肢體導聯心電圖(ECG)。記錄15 min正常時的心電圖后，剔除心電圖異常者。在胸骨左旁開0.5 cm處做一約2 cm的縱向切口，大致位于兩前肢后緣連線至第5肋骨水平。分離皮下筋膜，鈍性分離第3肋、第4肋的胸淺肌和胸深肌，剪斷第3肋、第4肋骨，剪開心包膜，暴露心臟，確認左前降支的位置。于左心耳下緣約2 mm處的冠狀動脈左前降支下穿6-0號帶針縫合線，從肺動脈圓錐旁出針，拉緊絲線，觀察心電圖改變和心肌顏色變化，見到結扎部位上下約2 mm范圍的心肌顏色發白，心電圖ST段抬高說明結扎成功。結扎45 min后，剪開線結進行再灌注，心肌由蒼白變得紅潤，在開始灌注的時候會出現再灌注心律失常。隨后胸前切口逐層縫合，用注射器抽吸清除胸腔內殘留氣體，關胸后予以脫機，放回籠中。

1.5.2 實驗分組 按照隨機對照原則，將30只大鼠分為空白組(假手術組)、模型組和治療組各10只。模型組和治療組分別結扎心臟左前降支45 min，空白組只穿線不結扎，其余步驟各組均相同。模型組和空白組灌胃生理鹽水4 mL，連續治療2周。治療組給予逸心湯，每只4 mL，每日1劑，每天灌胃給藥，治療2周。

1.6 指標檢測

1.6.1 氧化應激水平評價 治療2周后，各組大鼠均用2%戊巴比妥鈉，按100 g體重0.3 mL腹腔注射麻醉后，腹主動脈采血，采用相應試劑盒檢測各組大鼠血清SOD、MDA及ROS水平。

1.6.2 心肌細胞凋亡檢測 治療2周后，各組大鼠均用2%戊巴比妥鈉，按100 g體重0.3 mL腹腔注射麻醉后，用生理鹽水心臟灌注后，取整個心臟放在4%多聚甲醛中固定后，并取心肌組織進行病理蘇木精-伊紅(HE)染色，采用TUNEL法檢測各組大鼠心肌細胞凋亡水平。

1.6.3 心肌組織病理HE染色 每只動物取心臟同一部位組織，經過烤片、切片、脫臘、浸洗、蘇木精及伊紅染色、沖洗、脫水、封片，顯微鏡下觀察。

2 結 果

2.1 各組氧化應激指標比較 模型組MDA水平明顯高于空白組(P<0.05)，治療組MDA水平明顯低于模型組(P<0.05)，治療組MDA水平與空白組比較差異無統計學意義(P>0.05)。3組間SOD水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。模型組ROS水平明顯高于空白組(P<0.05)，治療組ROS水平明顯低于模型組(P<0.05)，但高于空白組(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組氧化應激指標比較(±s)

2.2 各組細胞凋亡水平比較 治療組、模型組心肌細胞凋亡水平明顯高于空白組(P<0.05)；模型組與治療組心肌細胞凋亡水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表2。

表2 各組心肌細胞凋亡水平比較(±s)

2.3 各組心肌組織病理HE染色結果 病理組織形態學結果顯示，模型組、治療組與空白組比較，可見心肌細胞變性，心肌纖維斷裂，心肌細胞間隙明顯增寬，炎細胞浸潤，而治療組與模型組比較，心肌細胞變性及炎細胞浸潤程度較輕。詳見圖 1。

圖1 各組心肌組織病理切片圖(HE，×400)

3 討 論

MIRI的發生是由多環節、多因素共同促成，其病因復雜。目前認為氧自由基產生、鈣超載、凋亡基因的激活在MIRI中起著重要作用[1]。氧化應激是MIRI的重要原因之一，由此，可以通過測定氧化應激相關指標，來了解體內氧化及抗氧化水平。MDA是脂質過氧化過程的副產物之一，可間接地反映自由基攻擊的嚴重程度，其含量高低反映了氧自由基在細胞內的生成水平及其對細胞的損傷程度[2]。SOD是體內清除自由基的主要成分，其活力可反映機體清除氧自由基的能力[3]。ROS是線粒體產生的一種體內代謝產物，過度累積的ROS可造成粥樣硬化斑塊不穩定，甚至破裂等情況，從而引起心腦血管事件[4]。因此，可以通過測定MDA、SOD、ROS的含量來評價MIRI氧化應激水平。在本研究中，模型組及治療組MDA、ROS明顯高于空白組，說明結扎左前降支的模型組和治療組大鼠均存在MIRI，其氧自由基水平增高，且治療組MDA及ROS水平明顯低于模型組，表明逸心湯對MIRI具有一定的保護作用。但在本研究中3組間SOD比較差異無統計學意義，可能與促氧化、抗氧化失衡有關，但不排除與樣本量小有關，有待進一步研究。

本研究采用結扎大鼠心臟左前降支的方法制備急性心肌梗死模型，該造模方法成功率高，操作簡便，與臨床急性心肌梗死相似，是急性心肌梗死常用的動物造模方法[5]。在本研究中，結扎心臟左前降支的治療組與模型組心肌細胞凋亡水平均明顯高于空白組，但治療組與模型組心肌細胞凋亡水平比較差異無統計學意義，考慮可能與樣本量較小有關。

逸心湯中以丹參、瓜蔞為君藥，二藥合用有助于加強祛痰化瘀、改善微循環的作用，再配以半夏、薤白、桃仁、紅花、茯苓、黃芪為臣藥，諸藥合用具有益氣化痰祛瘀之功效，在前期慢性心力衰竭及穩定型心絞痛的臨床觀察中亦取得了良好的療效[6-7]，體現了驗方逸心湯“辨證論治，治病求本”的精髄，也符合當前精準化、個體化治療的理念。

現代研究表明，瓜蔞在抗動脈粥樣硬化的過程中具有調節脂質代謝、抗炎、抗氧化、抗血管內皮損傷、抑制平滑肌細胞增殖、穩定斑塊、擴血管、抑制血小板血栓形成，延長缺氧耐受時間，改善缺血再灌注損傷等作用[8-9]。丹參、川芎能改善心肌舒縮功能，清除氧自由基，改善MIRI，促進心功能恢復[10]。桃仁、紅花可有效改善血小板聚集和凝血功能，擴張冠狀動脈[11]。薤白有保護內皮并改善其功能紊亂，改善心肌缺血，從而保護衰竭的心肌細胞的作用[12]。

綜上所述，逸心湯具有活血化瘀、祛痰通絡的功效，對MIRI有一定的保護作用，其機制可能與多靶點調節血管內皮細胞功能，抗血小板聚集，改善氧化應激損傷，從而減少心肌損害有關[6]。