肌酸激酶MM同工酶在新生兒杜氏肌營養(yǎng)不良癥篩查中的應(yīng)用

王燕敏， 田國力， 紀(jì) 偉， 張瀟分

（上海市兒童醫(yī)院新生兒篩查中心，上海 200040）

杜氏肌營養(yǎng)不良癥（Duchenne muscular dystrophy，DMD）是進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良癥中最常見也是病情最嚴(yán)重的一種遺傳病，男性新生兒的發(fā)病率為1/6 000～1/5 000[1]。DMD是由于X染色體上編碼抗肌萎縮蛋白基因突變，導(dǎo)致抗肌萎縮蛋白缺失或缺陷，起病較隱匿，女性多為攜帶者，男性患者多于3～5歲起病，常表現(xiàn)為進(jìn)行性加重的肌無力、肌萎縮及站立困難，10～12歲出現(xiàn)站立或行走困難，只能靠輪椅行動(dòng)，20歲時(shí)需要輔助呼吸，30～40歲時(shí)因呼吸或心力衰竭而死亡。在DMD患兒出現(xiàn)臨床癥狀前進(jìn)行診斷，結(jié)合多學(xué)科的綜合評(píng)估和管理，可極大延長(zhǎng)患者獨(dú)立行走的時(shí)間和生存期，提高患者的生存質(zhì)量[2-3]。英國、德國、美國等國家已進(jìn)行新生兒DMD篩查，以肌酸激酶（creatine kinase，CK）作為篩查指標(biāo)，若呈陽性則召回患兒進(jìn)行DMD基因檢測(cè)[4]。肌酸激酶MM同工酶（creatine kinase isoenzyme MM，CK-MM）是骨骼肌中CK的主要同工酶形式，其在DMD患者中更具特異性[5]。本研究擬評(píng)估CK-MM用于DMD篩查的可行性，為今后廣泛開展新生兒DMD篩查提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

1.1.1 男性新生兒濾紙干血片樣本 收集2019年6—10月上海市兒童醫(yī)院新生兒篩查中心進(jìn)行遺傳病篩查的男性新生兒濾紙干血片樣本7 035份，男性新生兒出生體質(zhì)量為3 373（1 100～5 490）g，母親孕周為39（28～43）周，采血時(shí)間為出生后4（2～6）d。按美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）C28-A3c文件的要求，將所有檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行排序，以低于第97.5百分位數(shù)（P97.5）者作為正常對(duì)照組。本研究經(jīng)上海市兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)，受檢者直系親屬均簽署知情同意書。

1.1.2 DMD患兒 選取2016年3月—2019年7月于上海市兒童醫(yī)院確診的DMD患兒25例，其中男24例、女1例，年齡2個(gè)月～12歲。患兒臨床表現(xiàn)為雙下肢無力、易摔倒、步態(tài)異常、心肌酶譜異常、進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良、肌源性損傷等。實(shí)驗(yàn)室診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]：血清CK異常，多重連接依賴式探針擴(kuò)增技術(shù)（multiplex ligationdependent probe amplification，MLPA）、醫(yī)學(xué)外顯子組序列和拷貝數(shù)分析后確認(rèn)為DMD基因缺失、增加或變異。在患兒進(jìn)行相關(guān)遺傳咨詢時(shí)，本著自愿的原則，獲得患兒父母知情同意后采集患兒外周血樣本。

1.2 方法

采集所有對(duì)象微量血，滴于S&S903濾紙上，室溫下自然晾干，-20 ℃冰箱保存待檢。取3 mm直徑血斑統(tǒng)一檢測(cè)。

Genetic Screening Processor 2021全自動(dòng)熒光免疫分析儀及配套CK-MM測(cè)定試劑盒（時(shí)間分辨熒光法）、Panthera-Puncher 9打孔儀均購自美國PerkinElmer公司。嚴(yán)格按儀器和試劑說明書進(jìn)行操作。

1.3 CK-MM檢測(cè)原理

采用固相雙抗體雙位點(diǎn)熒光免疫法檢測(cè)CKMM。微孔板上固相小鼠單克隆抗體和銪離子標(biāo)記的小鼠單克隆抗體可識(shí)別CK-MM分子表面2個(gè)獨(dú)立的抗原位點(diǎn)并發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，未結(jié)合的標(biāo)記從板孔中沖離。加入誘導(dǎo)劑將已結(jié)合的銪離子從微孔板上洗脫并與誘導(dǎo)劑中的成分形成具有高熒光強(qiáng)度的螯合物。該螯合物的熒光強(qiáng)度與濾紙干血片樣本中的CK-MM濃度呈正比。

1.4 DMD診斷流程

若濾紙干血片樣本的CK-MM檢測(cè)結(jié)果高于篩查人群的P97.5[7]，判定為篩查陽性，需進(jìn)一步采集靜脈血檢測(cè)血清CK，如血清CK＞200 U/L判定為異常，隨后行MLPA、醫(yī)學(xué)外顯子組序列和拷貝數(shù)分析，若有DMD基因缺失、增加或變異則確診為DMD。

1.5 方法學(xué)評(píng)價(jià)

1.5.1 精密度 取CK-MM試劑盒提供的低值（138 ng/mL）、中值（402 ng/mL）和高值（1 660 ng/mL）質(zhì)控樣本，每份樣本各測(cè)定20次，計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）；每份樣本各測(cè)定4次，連續(xù)測(cè)定5 d，計(jì)算批間CV。

1.5.2 正確度 取低值（138 ng/mL）、中值（402 ng/mL）和高值（1 660 ng/mL）質(zhì)控樣本，復(fù)孔檢測(cè)，重復(fù)測(cè)定15次，計(jì)算均值與靶值的偏移。

1.5.3 線性范圍 取試劑盒提供的已知濃度的校準(zhǔn)品（8 000 ng/mL），取直徑3 mm的血斑樣本，按1、1/2、1/4、1/8血斑制作系列濃度樣本，每份樣本重復(fù)檢測(cè)2次。以理論值為X，實(shí)測(cè)值均值為Y，計(jì)算回歸方程和r值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Excel 2010軟件及SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單樣本K-S檢驗(yàn)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)。非正態(tài)分布資料以中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評(píng)估CK-MM篩查DMD的效能。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 時(shí)間分辨熒光法檢測(cè)CK-MM的方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.1.1 精密度結(jié)果 低、中、高值樣本的批內(nèi)CV分別為9.89%、7.08%、7.27%，批間CV分別為8.35%、7.13%、7.37%，均＜10%。見表1。

表1 時(shí)間分辨熒光法檢測(cè)CK-MM的精密度結(jié)果

2.1.2 正確度結(jié)果 低值、中值、高值樣本的偏移范圍分別為-9.34%～12.79%、-10.27%～12.23%、-10.15%～13.51%，均在±15%之間，平均相對(duì)偏移分別為0.32%、-1.09%、0.80%。見圖1。

圖1 時(shí)間分辨熒光法檢測(cè)CK-MM的偏移分布

2.1.3 線性結(jié)果 以實(shí)測(cè)均值為Y，系列理論值為X，進(jìn)行線性回歸分析，線性范圍為6.8～8 780 ng/mL，回歸方程為Y=1.045 8X+1.929 6（r=0.999 9，P＜0.01）。實(shí)測(cè)均值與理論值高度相關(guān)，線性良好。

2.2 新生兒篩查結(jié)果

7 035 名男性新生兒的CK-MM濃度范圍為8.68～7 271.91 ng/mL，數(shù)據(jù)呈正偏態(tài)分布（P＜0.000 1）。CK-MM中位數(shù)為93.06 ng/mL，主要分布范圍為8.68～400.00 ng/mL，占總樣本數(shù)的96.49%，＞400 ng/mL的累積百分比增長(zhǎng)趨緩。見圖2。

圖2 7 035名男性新生兒濾紙干血片樣本CK-MM濃度分布及累積百分比

按CLSI C28-A3c文件的要求，以P97.5的值（713 ng/mL）為初始臨界值，7 035名男性新生兒中有6例（0.085%）CK-MM≥713 ng/mL（篩查陽性），均值為2 189.02 ng/mL，范圍為713.33～7 271.91 ng/mL；有7 029名CK-MM＜713 ng/mL（正常對(duì)照者），數(shù)據(jù)呈正偏態(tài)分布（P＜0.000 1），為91.93（60.16～139.65）ng/mL。

6例篩查陽性患兒召回后進(jìn)行血清CK檢測(cè)，4例結(jié)果正常，排除DMD；2例CK結(jié)果分別為3 270、13 100 U/L，檢測(cè)DMD基因，均為半合變異，基因型分別為c.1990C＞T（p.Gln664*）和c.7657C＞T（p.Arg2553*），確診為DMD。CK-MM篩查新生兒DMD的陽性預(yù)測(cè)值為33.33%（2/6），男性發(fā)病率為1∶3 518。

2.3 CK-MM診斷DMD的效能評(píng)價(jià)

27例DMD患兒（25例DMD患兒，2例篩查確診患兒）的基因檢測(cè)結(jié)果分別為半合缺失21例、拷貝數(shù)增加1例、女性雜合缺失1例、半合變異4例。DMD患兒CK-MM濃度為6 169.69（2 361.13～8 301.66）ng/mL，明顯高于正常對(duì)照組[91.93（60.16～139.62）ng/mL]（P＜0.000 1），是正常對(duì)照組的67倍。27例DMD患兒CK-MM、CK及基因檢測(cè)結(jié)果見表2。

ROC曲線分析結(jié)果顯示，以正常對(duì)照組為對(duì)照CK-MM診斷DMD的曲線下面積（area under curve，AUC）為1.0，最佳臨界值為762 ng/mL，敏感性為100%，特異性為99.94%。見圖3。

表2 27例DMD患兒CK-MM、CK及基因檢測(cè)結(jié)果

圖3 CK-MM診斷DMD的ROC曲線

3 討論

DMD是最常見的X連鎖先天性肌病，至今無治愈手段。近年來，隨著藥物治療、基因治療、骨髓干細(xì)胞移植等取得的重大進(jìn)展，DMD逐步受到臨床關(guān)注[8-9]。有研究結(jié)果顯示，早期使用糖皮質(zhì)激素可有效改善患者的運(yùn)動(dòng)功能，提高患者的生存質(zhì)量和存活時(shí)間[6]。因此，在新生兒期對(duì)DMD進(jìn)行篩查可以早期診斷，盡早治療，結(jié)合心臟、呼吸、骨骼和康復(fù)等多學(xué)科干預(yù)可顯著提高患者生活質(zhì)量，延緩疾病進(jìn)程，延長(zhǎng)患者生存期，還能為有先證者家庭的下一胎產(chǎn)前診斷提供幫助。據(jù)美國醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)的報(bào)道，1975—2011年間全球有1 800萬新生兒接受DMD篩查，確診344例DMD[10]。1990—2011年間，英國威爾士地區(qū)采用CK篩查343 170名男嬰，確診72例DMD，男孩發(fā)病率為1∶4 767[11]。本研究對(duì)7 035名新生男嬰進(jìn)行篩查，確診2例DMD，發(fā)病率為1∶3 518。

CK一直是DMD診斷的重要指標(biāo)，這是由于DMD基因變異可引起肌肉發(fā)生萎縮或炎癥，CK從被破壞的肌肉組織中釋放進(jìn)入血液，使血清CK濃度升高。但CK濃度易受年齡、性別、種族、地域、運(yùn)動(dòng)狀態(tài)、疾病等多種因素的影響，且如何界定CK檢測(cè)值與DMD之間的關(guān)系尚無明確標(biāo)準(zhǔn)[12]。CK-MM是CK在骨骼肌中存在的主要同工酶形式，CK-MM作為骨骼肌損傷的指標(biāo)比CK更具特異性[13]，且相對(duì)于檢測(cè)血清CK，檢測(cè)濾紙干血片樣本CK-MM的創(chuàng)傷更小、成本更低，且運(yùn)輸方便，適合大規(guī)模篩查[5]。本實(shí)驗(yàn)室在國內(nèi)率先通過檢測(cè)濾紙干血片中的CK-MM開展新生兒DMD篩查。本研究對(duì)時(shí)間分辨熒光法檢測(cè)濾紙干血片CK-MM的性能進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示批內(nèi)CV、批間CV和平均偏移均＜10%，實(shí)測(cè)值與理論值的r=0.999 9。27例DMD患兒的CK-MM均＞1 000 ng/mL，中位濃度是正常對(duì)照組的67倍。ROC曲線分析結(jié)果顯示，CK-MM診斷DMD的敏感性為100%，特異性為99.99%，提示CK-MM對(duì)DMD有很好的診斷價(jià)值。

DMD為X連鎖遺傳，女性多為無癥狀攜帶者，但約有10%的女性攜帶者可有輕度的臨床表現(xiàn)，極少數(shù)出現(xiàn)類似于男性患兒的嚴(yán)重癥狀，部分女性成年期出現(xiàn)DMD相關(guān)性擴(kuò)張性心肌病，引起左心室擴(kuò)張和充血性心力衰竭[14]。本研究中有1例女性DMD雜合子基因確診患者，CK-MM為1 949.46 ng/mL，因CK濃度升高就診，就診時(shí)已見步態(tài)異常。因本研究未將女性新生兒納入篩查，所以無女性DMD發(fā)病率等數(shù)據(jù)。此例患兒提示今后應(yīng)不分性別對(duì)所有新生兒開展DMD篩查。

綜上所述，以濾紙干血片為樣本檢測(cè)CK-MM能有效篩查出DMD患兒，且檢測(cè)方法簡(jiǎn)便，值得在臨床推廣。