血清維生素E結合蛋白及adropin蛋白在DN中的臨床價值

田 茜， 李寶新， 李 娜， 郭淑芹， 張瑪麗， 李 杰， 王 翯， 張云良

（1.承德醫學院研究生學院，河北 承德 067000；2.保定市第一中心醫院內分泌科 河北省光學感知技術創新中心，河北 保定 071000）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病主要的慢性微血管并發癥之一，其特征為蛋白尿和不可逆性腎功能衰竭，最終導致終末期腎病[1]。盡管微量白蛋白（microalbumin，mAlb）尿是DN早期診斷的金標準，但并不能準確地預測DN的發生風險。因此，發現更早預測DN及預防腎功能衰竭的血清標志物成為研究熱點[2]。DN的病情復雜多樣，發病機制尚不明確，長期血糖、血脂控制不佳及胰島素抵抗可能會導致DN病情加速進展[3]。維生素E結合蛋白（afamin，AFM）主要由肝臟合成，屬于白蛋白超家族，可參與炎癥免疫反應，同時調節血脂及胰島素抵抗等代謝環節，影響血糖水平及體質量[4]。有研究結果顯示，adropin蛋白（AD）是與代謝穩態相關的蛋白，具有延緩血管內皮細胞發生氧化應激，促進脂質代謝，提高血糖利用等作用[5-6]。AFM和AD可影響多種代謝途徑，但在DN患者中的變化及影響因素尚不明確。為此，本研究擬探討血清AFM及AD在DN患者中的臨床價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2016年12月—2018年12月于保定市第一中心醫院內分泌科就診的2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）患者180例，其中男88例、女92例，參照1999年世界衛生組織推薦的T2DM診斷標準[7]確診。參考世界衛生組織推薦的DN診斷標準[8]，根據尿白蛋白/肌酐比值（urinary albumin to creatinine ratio，UACR）將T2DM患者分為3組：（1）正常UACR組（UACR＜30 mg/g），共60例，其中男28例、女32例，年齡（55.47±8.55）歲；（2）低UACR組（UACR為30～＜300 mg/g），共61例，其中男31例、女30例，年齡（57.39±7.48）歲；（3）高UACR組（UACR≥300 mg/g），共59例，其中男29例、女30例，年齡（59.14±7.37）歲。排除標準：（1）合并急性糖尿病并發癥；（2）合并原發性腎病；（3）合并急、慢性感染性疾??；（4）合并自身免疫系統性疾病、血液系統疾病、惡性腫瘤等；（5）心、腦血管疾病急性加重期。選取同期保定市第一中心醫院體檢健康者52名（正常對照組），其中男24名、女28名，年齡（55.46±7.17）歲。本研究獲得保定市第一中心醫院倫理委員會審核批準，所有對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

收集所有對象的一般資料，包括性別、年齡、血壓、身高、體質量及糖尿病病程等，計算體質量指數（body mass index，BMI）。采集所有對象空腹8 h后的靜脈血10 mL，分離血清。

空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）、三酰甘油（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、血清肌酐（serum creatinine，SCr）、天門冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）試劑盒均購自北京九強生物技術股份有限公司；尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、總蛋白（total protein，TP）、白蛋白（albumin，Alb）試劑盒均購自北京利德曼生化股份有限公司；檢測儀器為7600全自動生化分析儀（日本日立公司）。

T2DM患者清晨7點排空膀胱后，開始留取尿液至次日清晨7點的最后1次排尿，將尿液混勻后取10 mL[9]，采用BA400全自動特定蛋白分析儀（重慶博士泰生物技術有限公司）及配套試劑檢測尿mAlb及24 h尿蛋白，計算尿白蛋白排泄率（urinary albumin excretion，UAE）、UACR。

采用HA8180全自動糖化血紅蛋白分析儀測定糖化血紅蛋白（glycated hemoglobin A1c，HbA1c）。采用cobas e601全自動電化學發光免疫分析儀（瑞士羅氏公司）及配套試劑（電化學發光法）測定空腹胰島素（fasting insulin，FINS），計算胰島素抵抗指數（homeostasis model assessment for insulin resistance，HOMAIR），公式為HOMA-IR=FBG（mmol/L）×FINS（mU/L）/22.5。

估算腎小球濾過率（estimated glomerular filtration rate，eGFR）的計算采用慢性腎臟疾病流行病學協作組（the Chronic Kidney Disease Epidemiology Collaboration，CKD-EPI）公式[10]。女性：當SCr≤62 μmol/L時，eGFR=144×（SCr/62）-0.329×0.993年齡；當SCr＞62 μmol/L時，eGFR=144×（SCr/62）-1.209×0.993年齡；男性：當SCr≤80 μmol/L時，eGFR=141×（SCr/80）-0.411×0.993年齡；當SCr＞80 μmol/L時，eGFR=141×（SCr/80）-1.209×0.993年齡。

采用酶聯免疫吸附試驗測定血清AFM和AD水平。AFM試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司，線性范圍為7.8～500.0 mg/L，批內變異系數（coefficient of variation，CV）＜8%，批間CV＜10%。AD試劑盒購自上海酶聯免疫生物有限公司，線性范圍為12.5～400.0 pg/mL，批內CV＜10%，批間CV＜15%。嚴格按試劑盒說明書進行操作。

1.3 統計學方法

采用SPSS 22.0統計軟件進行分析。呈正態分布的計量資料以x±s表示，2個組之間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素或多因素方差分析。呈非正態分布的計量資料資料采用中位數（M）[四分位數（P25～P75）]表示，2個組之間比較采用Nemenyi檢驗，多組間比較采用 Kruskal-WallisH檢驗。采用Spearman相關分析及多元逐步回歸分析血清AFM和AD水平與各項指標的關系。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評估AFM和AD診斷DN的價值。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 T2DM各組及正常對照組之間一般資料的比較

正常UACR組、低UACR組、高UACR組及正常對照組之間年齡、性別、BMI、舒張壓差異均無統計學意義（P＞0.05）。正常UACR組、低UACR組及高UACR組之間糖尿病病程差異無統計學意義（P＞0.05）。低UACR組及高UACR組收縮壓高于正常UACR組及正常對照組（P＜0.05）。見表1。

2.2 T2DM各組及正常對照組之間血液指標的比較

與正常對照組比較，正常UACR組、低U A C R組、高U A C R組F B G、B U N、HbA1c、HOMA-IR升高（P＜0.05），TP降低（P＜0.05）。高UACR組HbA1c及HOMA-IR高于正常UACR組（P＜0.05），其他指標在T2DM各組之間差異均無統計學意義（P＞0.05）。正常對照組、正常UACR組、低UACR組、高UACR組AFM水平依次升高，各組間差異均有統計學意義（P＜0.05）；AD和Alb依次降低，各組間差異均有統計學意義（P＜0.05）。Alb除正常UACR組與低UACR組之間差異無統計學意義（P＞0.05）外，其他各組之間差異均有統計學意義（P＜0.05）。4組之間TC、TG、AST及eGFR差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表1 T2DM各組及正常對照組之間一般資料的比較

表2 T2DM各組及正常對照組之間血液指標的比較 ±s

表2 T2DM各組及正常對照組之間血液指標的比較 ±s

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與正常UACR組比較，#P＜0.05；與低UACR組比較，△P＜0.05

組別 例數 FBG/（mmol/L） HbA1c/% FINS/（mU/L） HOMA-IR TC/（mmol/L）正常UACR組 60 8.91±2.81* 8.68±1.93* 10.46±3.97 4.16±2.08* 4.85±0.95低UACR組 61 9.59±3.36* 9.04±1.61* 11.15±4.03 4.82±2.62* 4.83±0.90高UACR組 59 9.87±3.47* 9.69±2.48*# 12.35±4.66*# 5.39±3.08*# 4.88±1.13正常對照組 52 5.42±0.42 4.72±0.60 9.60±2.36 2.32±0.61 4.92±0.66 F值 28.07 82.59 4.99 17.88 0.11 P值 0.00 0.00 0.00 0.00 0.95組別 TG/（mmol/L） AST/（U/L） TP/（g/L） Alb/（g/L） BUN/（mmol/L）正常UACR組 1.65±0.57 17.88±3.98 65.79±5.76* 42.73±3.75* 5.59±1.31*低UACR組 1.80±0.44 19.01±7.02 65.18±6.67* 42.06±3.91* 5.75±1.59*高UACR組 1.85±0.66 17.62±5.80 64.79±7.01* 39.79±5.04*#△ 6.30±2.31*正常對照組 1.67±0.42 19.34±5.15 68.89±5.50 49.93±6.01 4.59±1.14 F值 1.93 1.27 4.75 46.90 10.14 P值 0.13 0.29 0.00 0.00 0.00組別 SCr/（μmol/L） eGFR/[mL/（min·1.73 m2）] AFM/（mg/L） AD/（pg/mL）正常UACR組 63.03±9.79 100.92±12.37 80.51±27.00* 174.76±8.86*低UACR組 69.71±15.62# 98.78±18.71 99.55±24.67*# 158.36±12.01*#高UACR組 74.00±16.39*# 94.30±19.89 114.74±27.55*#△ 147.09±5.50*#△正常對照組 65.05±11.31 98.27±13.00 65.64±22.31 182.72±10.82 F值 7.59 1.68 39.67 157.85 P值 0.00 0.14 0.00 0.00

2.3 T2DM各組尿mAlb及UAE、UACR、24 h尿蛋白水平的比較

正常UACR組、低UACR組、高UACR組尿mAlb及UAE、UACR依次升高，各組間差異均有統計學意義（P＜0.05）。高UACR組24 h尿蛋白水平高于低UACR組、正常UACR組（P＜0.05）。見表3。

2.4 血清AFM和AD水平與其他指標的相關性分析

將尿mAlb、UAE、UACR及24 h尿蛋白進行對數轉換，使其呈正態分布。Spearman相關分析結果顯示，AFM與收縮壓、BUN、SCr、FBG、HbA1c、FINS、HOMA-IR、mAlb、UAE、UACR及24 h尿蛋白均呈正相關（r值分別為0.27、0.18、0.17、0.32、0.32、0.39、0.51、0.50、0.49、0.47、0.34，P＜0.05），與TP、Alb、AD均呈負相關（r值分別為-0.18、-0.32、-0.85，P＜0.05）。AD與TP及Alb均呈正相關（r值分別為0.19、0.45，P＜0.05），與收縮壓、BUN、SCr、FBG、HbA1c、FINS、HOMA-IR、mAlb、UAE、UACR、24 h尿蛋白及AFM均呈負相關（r值分別為-0.29、-0.29、-0.20、-0.46、-0.54、-0.36、-0.58、-0.72、-0.73、-0.73、-0.51、-0.85，P＜0.05）。

2.5 血清AFM及AD的影響因素

分別以AFM和AD為因變量，將Spearman相關分析中有相關性的項目作為自變量，進行多元線性回歸分析。結果顯示，血清AFM水平的影響因素為AD、HbA1c、UACR及24 h尿蛋白（β值分別為-0.90、0.11、0.16、0.11，P＜0.05），血清AD水平的影響因素為AFM、UACR及HbA1c（β值分別為-0.53、-0.45、-0.11，P＜0.05）。

表3 T2DM各組尿mAlb及UAE、UACR、24 h尿蛋白水平的比較 M（P25～P75）

2.6 血清AFM和AD診斷DN的效能

ROC曲線分析結果顯示，血清AFM診斷DN的曲線下面積（area under curve，AUC）[95%（confidence interval，CI）]為0.80（0.75～0.86），最佳臨界值為87.57 mg/L，敏感性和特異性分別為78.30%和71.50%。AD診斷DN的AUC（95%CI）為0.96（0.94～0.98），最佳臨界值為171.86 pg/mL，敏感性和特異性分別為97.50%和92.00%。見圖1。

圖1 AFM和AD診斷DN的ROC曲線

3 討論

DN是導致慢性腎功能不全的主要原因，目前全球DN的患病率呈上升趨勢[11]。DN的自然發病過程包括腎小球高濾過、進行性Alb尿、腎小球濾過率下降以及最終的終末期腎?。╡ndstage renal disease，ESRD）。盡管ESRD可能是DN最容易識別的結果，但大多數患者在需要腎臟替代治療前已死于并發的心血管疾病和感染[12]。因此，臨床亟需敏感的血清學標志物來盡早預測DN的發生，以改善DN患者的預后。

AFM是人類Alb基因家族的第4個成員，相對分子質量為87 000，主要由肝臟表達，同時也在腎臟、腦、睪丸和卵巢等組織和器官中表達[13]。有研究結果顯示，在轉基因小鼠體內過量表達人類afamin基因后，小鼠體質量增加，血清脂質和葡萄糖水平升高[14]。一項有20 000名個體參與的研究結果顯示，血清AFM水平與T2DM的患病率及胰島素抵抗密切有關。本研究結果顯示，與正常對照組比較，T2DM各組AFM水平均升高（P＜0.05），且AFM與HOMA-IR呈正相關（r=0.51，P＜0.05），與文獻報道[15]一致。AFM可通過上調葡萄糖代謝的關鍵酶和產物來使血糖水平升高，改變血脂分布，進而出現血壓升高、BMI增大等多種代謝綜合征表現，這些表現在DN的發生、發展中發揮了至關重要的作用。KABURAGI等[16]的研究結果顯示，DN患者尿液AFM/Cr比值明顯高于單純T2DM患者，提示尿液AFM水平與DN的進展有關。本研究結果顯示，隨著UACR水平的升高，T2DM各組的AFM水平依次升高，且以高UACR組為最高，提示隨著DN病情的進展，AFM水平逐漸升高。這可能與腎臟AFM表達增加，導致DN病情進展及肝臟AFM表達增加，引起胰島素抵抗有關。相關性分析及多元線性回歸分析結果顯示，AFM與長期血糖控制情況、胰島素抵抗、腎臟功能及Alb合成密切相關。AFM或可通過影響血糖水平及加重尿蛋白丟失情況，進一步加重DN患者的病情。因此，AFM可間接反映DN病情的嚴重程度。

AD是Enho基因編碼的，由76個氨基酸組成的肽類激素，主要在肝臟和中樞神經系統中表達[17]。AD是一種調節細胞-細胞通訊的膜結合蛋白，同時可存在于各種組織和體液中。AD參與了碳水化合物及脂質調節、能量穩態調節，與胰島素抵抗、中樞神經系統功能及內皮細胞功能密切相關[18]。有研究結果顯示，T2DM患者血清AD水平下降，可能與AD抑制體質量增加、增加胰島素敏感性、影響糖代謝和脂代謝有關[19]。動物實驗結果顯示，用AD治療可以降低鏈脲佐菌素誘導的T2DM大鼠模型的血糖水平并改善胰島素抵抗[20]。本研究結果顯示，正常UACR組AD水平低于正常對照組（P＜0.05），且高UACR組高于低UACR組和正常UACR組，說明DN與AD密切相關。相關性分析結果顯示，AD與收縮壓、BUN、SCr、FBG、HbA1c、FINS、HOMA-IR、mAlb、UAE、UACR、24 h尿蛋白均呈負相關（r值分別為-0.29、-0.29、-0.20、-0.46、-0.54、-0.36、-0.58、-0.72、-0.73、-0.73、-0.51，P＜0.05），提示AD可能通過調節患者血糖控制水平、胰島素水平及胰島素敏感性等方面來抑制糖尿病的發展，進而延緩糖尿病相關代謝變化導致的腎功能損傷。多元線性回歸分析結果顯示，影響AD表達的因素為AFM、UACR及HbA1c，提示DN患者隨著UACR水平的升高，AD逐漸降低，且與DN病變的嚴重程度相關。ROC曲線分析結果顯示，AFM及AD對DN的診斷均有一定的價值。

綜上所述，在DN患者中，隨著UACR水平的升高，AFM水平逐漸升高，AD水平逐漸下降，AFM和AD對DN均有一定的診斷價值。由于本研究的樣本量較小，相關結論需擴大樣本量進一步驗證，具體機制也需進一步研究。