黃連素體外抗川崎病兒童血小板聚集作用的探討

劉云鋒， 鄭 浩， 車 迪， 皮 蕾， 付蘭燕， 顧曉瓊

（1.廣州市婦女兒童醫療中心檢驗科，廣東 廣州 510623；2.廣州市婦女兒童醫療中心標本庫，廣東 廣州 510623）

川崎病（Kawasaki disease，KD）是一種以全身中、小動脈炎癥性病變為主要特征的急性發熱性疾病，可累及冠狀動脈引起冠狀動脈擴張和動脈瘤，流行病學研究結果顯示，近年來亞洲地區KD的發病率呈上升趨勢[1-2]。KD主要的病理特征為血液高黏、高聚、高凝，血小板（platelet，PLT）大量聚集并引起血栓栓塞[3]，是我國小兒后天性心臟病的主要原因之一。目前臨床上常以阿司匹林作為該病抗PLT聚集的藥物，但有研究結果顯示，部分患者會出現藥物抵抗、并發冠狀動脈損傷及黏膜損傷或消化道出血等不良癥狀[4]。近年來，黃連素（berberine，BB）作為中國傳統中藥，其抗PLT聚集的功能引起了人們的重視。BB能降低二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）、膠原和花生四烯酸誘導的PLT血栓素A2（thromboxane A2，TXA2）的釋放，能明顯地抑制PLT激活因子（platelet activating factor，PAF）途徑[5]，從而抑制PLT聚集。除此之外，有臨床研究結果表明，BB能改善同樣具有血液高黏、高聚等血液流變學改變的2型糖尿病，降低其血漿黏度、減少紅細胞和PLT聚集[6]。然而，BB是否能改善KD患者PLT聚集情況，尚未見文獻報道。本研究通過體外實驗，觀察BB能否降低KD患兒PLT聚集率，為BB用于KD的抗栓治療提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2015年8月—2019年8月在廣州市婦女兒童醫療中心心血管科確診的71例KD患兒作為KD組，其中男45例、女26例，年齡（2.81±1.22）歲；另選取同期在兒童保健科就診的71名健康兒童作為對照組，其中男49例、女22例，年齡（2.48±1.31）歲。2組研究對象年齡、性別差異無統計學意義（P＞0.05）。KD患兒均采用2004年美國心臟協會制定的診斷指南[7]確診，所有患兒均排除腺病毒感染、EB病毒感染、藥物過敏綜合征、Stevens-Johnson綜合癥、猩紅熱等發熱性疾病。對照組兒童均排除既往KD病史、感染性疾病、心血管疾病、阿司匹林過敏癥、PLT減少癥等。

1.2 方法

采集所有研究對象全血并用乙二胺四乙酸抗凝，110×g離心5 min，分離上層富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP）。取500 μL PRP并加入等量0.9%氯化鈉溶液后混勻，110×g離心5 min，洗滌1次后棄去上清，加入500 μL 0.9%氯化鈉溶液重懸并調節PLT濃度為（100～300）×109/L。加入0.025 mol/L氯化鈣15 μL混勻，靜置30 min待測。運行PLT聚集儀（美國Helena Laboratories公司），取靜置后的待測標本分成2份，每份各200 μL。使用0.9%氯化鈉溶液對儀器進行空白校準。校準完成后其中1份加入二甲基亞砜25 μL，另一份加入5 mg/mL BB 25 μL，37 ℃溫浴3 min后，迅速加入5 μmol/L ADP（美國Helena Laboratories公司）25 μL開始測定，使用PLT聚集儀繪制PLT聚集曲線并獲得最大聚集率。

1.3 統計學方法

采用SPSS 21.0軟件進行統計學分析。呈正態分布的計量資料以x±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。呈偏態分布的計量資料以中位數（M）[四分位數（P25～P75）]表示，組間比較采用秩和檢驗。樣本間計數資料比較采用配對t檢驗分析。年齡、性別等計量資料的相關性采用Pearson相關性分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實驗條件選擇

對不同離心速度（90、110、130×g）和不同離心時間（5、8、10、15 min）進行比較，結果顯示，110×g離心5 min所得PRP的PLT濃度最高。見表1。

2.2 BB濃度選擇

選擇10例健康體檢者標本，分別加入二甲基亞砜及不同濃度BB（0、2.5、5.0、10.0 mg/mL）各25 μL后測定PLT最大聚集率。結果顯示，當BB濃度為0、2.5、5.0、10.0 mg/mL時，PLT最大聚集率分別為32.1（27.0～37.8）%、21.6（15.3～23.4）%、11.2（9.0～18.3）%、 10.7（8.1.0～17.4）%，因此選取5 mg/mL為BB最適實驗濃度。

2.3 BB對PLT聚集率的影響

KD組和對照組的PLT最大聚集率均下降，2組樣本添加BB前、后PLT聚集率比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 添加BB前、后PLT聚集率比較 %，±s

表2 添加BB前、后PLT聚集率比較 %，±s

注：與添加BB前PLT聚集率比較，*P＜0.05

組別 例數 加BB前 加BB后 t值 P值對照組 71 26.25±3.32 10.32±2.11* 9.523 ＜0.05 KD組 71 18.32±2.51 6.23±1.59*10.987 ＜0.05

3 討論

KD是一種以全身小動脈炎為病理改變的疾病，多發于嬰幼兒及兒童，絕大多數患者經過丙種球蛋白治療后可逐漸轉歸，預后良好。但15%～30%的患者可侵犯冠狀動脈，嚴重者可并發冠狀動脈瘤破裂、心肌梗死等，是兒童后天性心臟病的主要原因[7]。KD患者由于免疫功能異常，在炎性因子作用下，血管內皮細胞受到刺激，內皮下的膠原組織暴露，誘導血液中的PLT及淋巴細胞、單核細胞黏附于暴露的膠原纖維上；同時PLT發生形態變化，貯存于致密顆粒內的ADP及5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）被釋放，進一步促使PLT聚集。由于血液長期處于高凝高聚狀態，容易形成血栓引起冠狀動脈嚴重狹窄和閉塞，甚至會形成冠狀動脈瘤，危害兒童健康。

阿司匹林是目前最主要的治療K D的抗栓藥物，主要通過抑制P LT環氧化酶（cyclooxygenase，COX）乙酰化，阻止花生四烯酸（arachidonic acid，AA）轉變為前列腺素環內過氧化物，阻斷TXA2生成[8]，從而達到抗PLT聚集的目的。但阿司匹林治療存在個體差異，少數個體使用阿司匹林后低反應或無反應，也有報道稱長期大劑量服用阿司匹林，以及在服用阿司匹林藥物時感染水痘或流感病毒的患兒發生瑞氏綜合征的風險較其他兒童高[9]。由于阿司匹林抗栓治療存在局限性，所以臨床上需要有其他藥物協助阿司匹林一同改善KD患兒PLT聚集情況。

BB是從毛茛科黃連植物根狀莖中提取的一種植物生物堿，以前主要用于治療腸道炎癥伴發熱。近年來有研究發現，BB具有明顯的抗腫瘤及抗2型糖尿病的作用[6]。另有研究結果顯示，BB是一種具有抑制凝血酶誘導PLT活性的直接凝血酶抑制劑[10]。BB主要通過降低TXA2、提高環磷腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）含量來調節PLT聚集的第二信使Ca2+，使Ca2+從致密小管載出減少，抑制PLT釋放功能。cAMP含量增高能夠抑制磷酯酶A的活化，從而通過抑制PAF途徑[5]，達到抗PLT聚集的目的。有研究結果表明，BB聯合其他常規藥物能更有效地抑制PLT聚集[11]。

本研究通過體外實驗，比較加入BB前、后KD組和對照組PRP PLT聚集率的變化，初步探討BB是否具有抗KD患兒PLT聚集的作用。實驗結果表明，使用110×g離心5 min制備PRP，體外加入5 mg/mL BB溶液進行預處理為最適反應條件。本研究結果顯示，對照組和KD組PRP體外經BB溶液處理后，PLT聚集率均比處理前有所降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。而且經BB處理后KD組PLT聚集率與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），表明BB在體外能有效發揮抗PLT聚集作用。本研究中KD組基礎PLT聚集率為（18.32±2.51）%，比正常組PLT聚集率[（26.25±3.32）%]低，這可能是由于本實驗使用的KD患兒標本均是在患兒確診并使用阿司匹林抗栓治療后收集的，導致KD組基礎PLT聚集率比對照組低。然而即便如此，加入BB后，對照組與KD組PLT聚集率仍明顯降低，由此推測，BB和阿司匹林可能在抗栓治療上有協同作用。

由于本研究樣本量小，未能進行深入研究，也未進行相關動物實驗驗證，希望今后進一步驗證BB在KD患兒抗栓治療中的作用，降低KD患兒血栓形成風險提供參考。