快速病原體檢測技術在甲型流感病毒檢測中的應用

付曉蕊， 康蓓佩， 徐修禮， 趙 峰， 張鵬亮， 周 磊

（1. 空軍軍醫大學第一附屬醫院檢驗科 全軍臨床檢驗醫學研究所，陜西 西安 710032；2. 空軍軍醫大學第一附屬醫院呼吸內科，陜西 西安 710032）

急性呼吸道感染（acute respiratory infection，ARI）是社區和醫院感染的主要感染之一。甲型流感病毒（influenza A virus，FluA）感染率高，影響范圍廣，已引起臨床的高度關注。病毒感染可以通過傳統的方法來檢測，如培養或檢測病毒的特異性抗原，也可以通過免疫色譜法或分子核酸檢測等方法快速檢測[1]。如何選擇敏感性高、特異性強的FluA檢測方法，更好地為臨床提供快速、準確的病原學依據，是臨床實驗室的重要任務。本研究通過分析FluA特異性抗原和核酸的檢測結果，探討快速病原體檢測技術的臨床應用價值。

1 材料和方法

1.1 樣本來源

收集2016年10月—2019年1月空軍軍醫大學第一附屬醫院臨床癥狀為發熱、咳嗽的疑似FluA感染患者鼻咽拭子樣本，其中FluA抗原篩查樣本14 179例，FluA核酸檢測樣本3 697例。另收集同期臨床癥狀為發熱、咳嗽的疑似呼吸系統感染患者鼻咽拭子樣本312例、支氣管肺泡灌洗液樣本3例，采用FilmArray快速呼吸道病原體檢測技術檢測常見呼吸道感染相關病原體，并對所有患者臨床資料進行回顧性分析。本研究經空軍軍醫大學第一附屬醫院倫理委員會審核通過，所有患者均知情同意。

鼻咽拭子及支氣管肺泡灌洗液樣本采集后，放入轉運培養基中，室溫放置不超過4 h，（2 ～8）℃不超過3 d，≤-15 ℃不超過30 d，樣本避免反復凍融。

1.2 方法

1.2.1 FluA抗原檢測 采用酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測樣本中的特異性FluA抗原，試劑盒購自北京萬泰股份有限公司。嚴格按照試劑說明書進行操作。

1.2.2 FluA核酸檢測 采用聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）-熒光探針法檢測FluA核酸，試劑盒購自達安基因股份有限公司。嚴格按照試劑說明書進行操作。

1.2.3 Film Array快速呼吸道病原體檢測 FilmArray快速呼吸道病原體檢測試劑盒及全自動醫用PCR分析系統購自法國生物梅里埃公司，可同步對多種呼吸道病原體的核酸進行擴增與檢測。嚴格按照儀器和試劑說明書進行操作。

1.3 統計學方法

采用SPSS 26.0軟件進行統計分析，計數資料以例或率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FluA抗原與核酸檢測結果

14 179例FluA抗原篩查樣本中，陽性1 355例，抗原篩查陽性率為9.56%；3 697例FluA核酸檢測樣本中，陽性1 009例，核酸檢測陽性率為27.29%。見表1。

表1 FluA核酸及抗原檢測結果比較 例

2.2 FluA感染的時間分布

FluA抗原檢測的平均陽性率為9.56%，FluA核酸檢測的平均陽性率為27.29%；暴發季（12月—次年2月）FluA抗原檢測陽性率為10.95%，FluA核酸檢測陽性率為27.71%。見圖1。

圖1 2016年10月—2019年1月FluA時間分布

2.3 FluA感染年齡分布

＜5歲的嬰幼兒、約20歲的青少年以及＞90歲的老年人為易感人群，篩查的陽性率較高。見表2。

表2 FluA核酸檢測陽性患者年齡分布

2.4 FluA感染性別分布

2 075例男性患者FluA核酸檢測陽性573例，陽性率為27.61%；1 622例女性患者FluA核酸檢測陽性436例，陽性率為26.88%。男性與女性比較，FluA核酸檢測陽性率差異無統計學意義（χ2=0.227，P＞0.05）。

2.5 FilmArray快速呼吸道病原體FluA檢測結果

采用FilmArray快速呼吸道病原體檢測技術對312例發熱、咳嗽的疑似呼吸系統感染患者進行常見呼吸道感染相關病原體檢測，陽性170例，陽性結果207個，部分樣本檢測結果包括多項陽性結果，見表3。有2例暫未判斷出型別的FluA核酸檢測陽性樣本（圖2），因反應測試條中引物的局限性不能判定出型別，送西安市疾病預防控制中心檢測，回報結果為H5N1型流感病毒。

表3 FilmArray快速呼吸道病原體檢測結果

圖2 2株未判斷出型別的FluA實時PCR溶解曲線

3 討 論

FluA可通過空氣或飛沫傳播，所致甲型流感為急性呼吸道傳染性疾病[2]。甲型流感能夠在短時間內出現聚集性暴發，潛伏期為1～7 d，早期癥狀與普通感冒相似，在臨床上主要表現為全身酸痛、咳嗽、咽痛、高熱困倦等[3-4]，病情嚴重時還會出現肌肉酸痛、腹瀉等癥狀。甲型流感起病較急、全身癥狀較輕，但病情嚴重者可以出現肺炎、呼吸衰竭等嚴重并發癥[5]，切斷早期傳播途徑和傳染源能夠有效地控制疫情的蔓延[6]。流感病毒有甲、乙、丙和丁4型，目前感染人的主要是FluA中的H1N1、H3N2亞型及乙型流感病毒中的Victoria和Yamagata系。近2年西安地區最主要的FluA型別為H1N1型和H3N2型[7-9]。

FluA抗原檢測屬于定性檢測，僅進行FluA核蛋白抗原檢測，由于免疫學檢驗存在一定的局限性，抗原篩查并不能確定感染時間和感染階段，故而應配合FluA核酸檢測。而單獨的FluA核酸檢測也存在感染時間、感染階段、核酸拷貝數低可能出現的假陰性結果等問題。此外，由于流感病毒待測靶序列的變異或其他原因導致的序列改變也會產生假陰性結果。對于突變的新型FluA，在其檢測的最適樣本類型及感染后的最佳采樣時間尚不明確時，均會對FluA核酸檢測結果產生影響，需要通過分次、多部位采集樣本來降低假陰性結果產生的可能性。

本研究結果顯示，FluA抗原檢測陽性率為9.56%，FluA核酸檢測陽性率為27.29%；暴發季（12月—次年2月）FluA抗原檢測陽性率為10.95%，FluA核酸檢測陽性率為27.71%。本研究發現，＜5歲的嬰幼兒、20歲左右的青少年以及＞90歲的老年人為易感人群，篩查的陽性率較高。與文獻報道的年齡＜5歲、＞65歲為高危人群，新生兒早期感染出現呼吸系統癥狀是正常人的3倍的結果[10]一致。嬰幼兒和老年人由于身體素質較差，抵抗力不足，容易出現相應的感染，且感染后病情嚴重、死亡的風險較高[11-12]；20歲左右的青少年多為學生和上班族，出現交叉感染的概率比較大，建議其預防性接種疫苗[7]。本研究結果顯示，近3年疑似FluA感染與性別無關。

FilmArray快速呼吸道病原體檢測技術采用巢式多重PCR技術，是集樣本制備、擴增、檢測和分析功能為一體的快速病原體檢測方法，可以同步檢測17種呼吸道病毒和3種細菌，僅需5 min的人工樣本處理和65 min的上機檢測時間，快速、方便，且靈敏度高，可快速報告檢測結果。

FilmArray快速呼吸道病原體檢測技術有其獨特的優勢，如肺炎支原體、肺炎衣原體非典型病原體、百日咳鮑特菌培養條件苛刻，而此方法可以快速報告結果，對疑難病例具有重要的臨床指導價值。本研究結果表明，人鼻/腸病毒檢測陽性率最高。但由于人鼻病毒與腸病毒的遺傳學相似性，該檢測方法不能將這2種病毒區分開，因此人鼻病毒和腸病毒合并為人鼻/腸病毒檢測[13]。快速病原體檢測技術還可以同時檢測到多種呼吸道相關病原體，有利于臨床及時了解患者感染情況，及時施治。

在FluA感染暴發季，FluA抗原篩查是病毒感染篩查的第一步，能更好地對FluA感染做出初步篩查和診斷。對于臨床疑似FluA感染或者呼吸道病毒感染患者，可以首先考慮同時進行FluA抗原篩查及FluA核酸檢測，快速明確病原體，從而預防性服用奧司他韋。奧司他韋聯合干擾素治療有利于各項臨床癥狀的消退，且患者耐受，可以提高治療效果。一般來說，奧斯他韋推薦使用5 d，但需要根據病毒學檢測結果及時調整[14]。如遇病情遷延不愈或高度懷疑病毒感染而又暫時無法確認時，可以考慮采用FilmArray快速呼吸道病原體檢測常見呼吸道感染相關病原體，更好地指導臨床合理使用藥物，對臨床呼吸道感染患者的診斷和治療有很重要的意義。