慢性阻塞性肺疾病急性加重風險高危與低危患者呼吸道微生態(tài)系統(tǒng)差異分析

盛美玲 汪群智

最新流行狀況調查顯示我國40歲以上人群COPD患病率已高達13.7%[1]。COPD患者非常容易出現(xiàn)反復的急性加重(AECOPD)，急性加重頻繁的患者有更快速的肺功能下降、更多的需要住院治療，并有抑郁、焦慮的發(fā)病率增加以及更差的生活質量，嚴重影響患者的健康狀況[2]。因此，減少COPD急性加重的發(fā)生，是COPD治療的最重要目標之一。近年來微生物高通量測序技術發(fā)展迅速，一些研究發(fā)現(xiàn)與COPD相關的呼吸道微生態(tài)系統(tǒng)變化是急性加重發(fā)生發(fā)展的一個重要組成部分[3]。故而，了解呼吸道微生態(tài)系統(tǒng)與COPD急性加重風險的關系，指導靶向干預以減少COPD急性加重和病情進展，有著重要的意義。

資料與方法

一、研究對象

選取我院呼吸內科2017年3月至2018年6月間就診的穩(wěn)定期COPD患者60例作為研究對象，所有患者簽署知情同意書。依據(jù)COPD指南《GOLD：Global Strategy for Diagnosis, Management, and Prevention of COPD，updated 2019》標準[4]，選擇在本院門診就診或出院后隨訪的穩(wěn)定期COPD患者，依據(jù)慢阻肺綜合評估方法，選擇急性加重風險高危組(A組)患者30例：患者上一年度發(fā)生過2次及以上的急性加重史或上一年度因急性加重住院1次，肺功能分級Ⅲ～Ⅳ級(肺功能提示FEV1占預計值%<50%)；低危組(B組)患者30例：患者上一年度發(fā)生過少于2次的急性加重史，且上一年度未因急性加重住院，肺功能分級Ⅰ～Ⅱ級(肺功能提示FEV1占預計值%≥50%)。當肺功能風險評估與急性加重史評估結果不一致時，以評估得到的最高風險為準。

二、分組

入組標準：COPD診斷符合GOLD 2019版《Global Strategy for Diagnosis, Management, and Prevention of COPD，updated 2019》[4]診斷標準分級并入組：在吸入支擴劑后，第1秒用力呼氣容積與用力肺活量的比值<70%并排除其它肺部疾?。换颊呔幱诓∏榫徑夥€(wěn)定期，近3月內患者咳痰、呼吸困難或喘息癥狀穩(wěn)定，近2月內未出現(xiàn)急性上呼吸道感染，近4周內沒有使用抗菌藥物或全身性激素；簽署知情同意書。排除標準：有其他肺部疾病如哮喘、肺癌、支氣管擴張癥、肺部結核等；有嚴重心、肝、腦、腎、癌癥、血液系統(tǒng)疾病、有自身免疫系統(tǒng)疾病者等。

三、方法

1 呼吸道標本樣本收集

用1%的利多卡因液霧化進行呼吸道局部麻醉，靜脈推注咪達唑侖2mg，患者取仰臥位，用纖維支氣管鏡行肺泡灌洗，將氣管鏡嵌入右肺中葉的一個亞段，頂端要緊密嵌頓亞段支氣管開口，防止大氣道分泌物混入和灌洗液外滲，共注入加熱至37℃的滅菌生理鹽水150mL，每次20～50mL，總回收率≥30%，回收后，初步質控，標本合格要求：(1) 灌洗液中沒有大氣道分泌物的混入；(2) 回收率>40%，活細胞占95%以上；(3) 紅細胞<10%，上皮細胞<5%；(4) 細胞形態(tài)完整、無變形，分布均勻。然后送到實驗室分裝后高速離心，后放置—80℃保存。同時留取5～10mL灌洗液送細菌室做細菌培養(yǎng)。

2 DNA抽提和PCR擴增

根據(jù)E.Z.N.A○Rsoil試劑盒(Omega Bio-tek,Norcross,GA,U.S)說明書進行總DNA抽提，DNA純度利用NanoDrop2000檢測，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量；用338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)引物對V3-V4可變區(qū)進行PCR擴增。擴增體系為 20ul，4ul 5*FastPfu 緩沖液， 2ul 2.5mM dNTPs，0.8ul 引物， 0.4ul FastPfu 聚合酶；10ng DNA 模板。

3 高通量測序

使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物后純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。利用QuantiFluorTM-ST (Promega, USA)進行檢測定量。根據(jù)Illumina MiSeq 平臺 (Illumina, SanDiego,USA)標準操作規(guī)程將純化后的擴增片段構建 PE2*300 的文庫。利用Illumina公司的Miseq PE300平臺進行高通量測序分析。

四、統(tǒng)計學方法

結 果

一、臨床資料

兩組患者一般資料 急性加重風險高危組患者(A組)30例，其中男性24例，女性6例，平均年齡(71.1±11.6)歲；急性加重風險低危組(B組)患者30例，其中男性23例，女性7例，平均年齡(70.7±10.5)歲；兩組間性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

二、高通量測序結果

1 60例標本稀釋曲線(圖1)。

2 60例標本Alpha多樣性分析(表1)：測序結果發(fā)現(xiàn)，兩組間呼吸道菌落在多樣性上無顯著性差異(P>0.05)。

表1 兩組患者呼吸道菌群Alpha多樣性指數(shù)組間差異數(shù)據(jù)表

圖1 60例BALF標本稀釋曲線

當曲線走向逐步趨向于平坦時，說明測序數(shù)據(jù)量足夠，由上圖可以看出，所有標本曲線均趨向于平坦，提示測序量合理。

3 60例標本門水平群落Bar圖(圖2)及屬水平Bar圖(圖3)：通過Bar圖我們可以發(fā)現(xiàn)，COPD患者BALF中微生物群非常豐富，且不同的樣本有著一定的差別，但主要以厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、放線菌門為主。但高危及低危組間微生物群在門、屬等水平上豐度有無差別仍需進一步做組間物種差異分析。

圖2 所有標本門水平群落Bar圖

圖3 所有標本屬水平群落Bar圖

圖2、3注解：橫坐標為相關物種在樣本中的比例，縱坐標是樣本編碼，不同的物種以不同的顏色表示。

4 兩組之間物種在門水平(圖4)及屬水平(圖5)的豐度差異分析：我們發(fā)現(xiàn)，在門水平上，A組患者BALF中梭桿菌門豐度明顯低于B組(t=-1.998，P=0.049)；在屬水平上，A組患者BALF中假單胞菌屬豐度明顯高于B組(t=4.380，P=0.001)。其它門、屬水平菌群豐度則無明顯差異(P>0.05)。

圖4 兩組患者門水平物種豐度差異

圖5 兩組患者屬水平物種豐度差異

討 論

長期以來，下呼吸道微生物的實驗室檢查主要依賴于呼吸道分泌物的細菌培養(yǎng)，但環(huán)境中大部分的微生物使用常規(guī)的實驗室培養(yǎng)方法并不能培養(yǎng)出，故而，人們長期錯誤的認為肺部是無菌環(huán)境。近年來以高通量測序技術對細菌16S rRNA進行測序為基礎的宏基因組學檢測方法的發(fā)展避免了分離培養(yǎng)的局限性，可全面深入的反映微生態(tài)系統(tǒng)結構和功能特點[5]，使呼吸道菌群多樣性的研究得到了明顯的進展。

近年來，基于16S rRNA的微生物結構分析方法已經(jīng)發(fā)現(xiàn)呼吸道微生物群在結構以及多樣性上非常豐富。Glendinning等[6]使用支氣管鏡對肺部取樣進行16s RNA測序，發(fā)現(xiàn)肺部的微生物群落豐富多樣。有學者研究發(fā)現(xiàn)健康人群和COPD患者的肺部存在的主要菌群相仿，均以鏈球菌屬、普雷沃氏菌屬、假單胞菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、梭桿菌屬、不動桿菌屬、葡萄球菌屬、韋榮氏菌屬為主，但是健康人群和COPD患者肺部中的微生物群在豐度上存在差異[7]。Pragman等[8]通過對中重度COPD患者的肺泡灌洗液測序發(fā)現(xiàn)，中重度COPD患者下呼吸道內變形菌門、厚壁菌門和放線菌門含量非常豐富。但是目前尚未有相關研究報道COPD急性加重高危及低?；颊咧g呼吸道微生態(tài)系統(tǒng)是否存在著差異。

我們通過對60例COPD患者的肺泡灌洗液行高通量測序發(fā)現(xiàn)，COPD患者BALF中微生物群非常豐富，以厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、放線菌門為主，與Cabrerarubio R[9]的研究高度一致，Ditz[10]通過對COPD患者的痰液菌群測序亦發(fā)現(xiàn)COPD患者呼吸道內4大常見的菌門為厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門和放線菌門。我們通過Alpha多樣性分析本研究發(fā)現(xiàn)兩組間微生物群的多樣性并無明顯差異，但是在豐度水平上部分菌群出現(xiàn)了一定差異，在門水平上，急性加重高危組患者BALF中梭桿菌門豐度明顯低于低危組；在屬水平上，急性加重高危組患者BALF中假單胞菌屬豐度明顯高于低危組。但是，是否由于這種菌群豐度的變化從而引起COPD的反復急性加重，本研究尚不能給出答案，仍需做進一步研究。

近年來，已經(jīng)有部分學者開始研究相關微生物功能，Ditz等[10]利用宏基因組學技術分析，發(fā)現(xiàn)與健康個體相比，COPD呼吸道細菌碳水化合物代謝基因明顯減少，核苷和核苷酸基因發(fā)生水平轉移，且氣流受限嚴重程度(FEV1)和細菌唾液酸代謝能力正相關。而Millares L[11]發(fā)現(xiàn)，在COPD穩(wěn)定期和急性加重的樣本之間，沒有發(fā)現(xiàn)到支氣管微生物群的種屬差異變化，基于MG-RAST宏基因組技術平臺分析發(fā)現(xiàn)，在急性加重期患者中，細菌在碳水化合物代謝、細胞生長和死亡以及運輸和分解代謝功能上出現(xiàn)了顯著的變化，揭示這種功能層面的變化而非種群結構的變化可能與COPD反復急性加重有關。但是，目前功能基因的全宏基因組檢測費用昂貴而限制了臨床的使用。

綜上所述，我們研究亦發(fā)現(xiàn)COPD患者的呼吸道微生物群非常豐富，以厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、放線菌門為主，COPD急性加重高危及低危患者呼吸道微生物群的多樣性并無明顯差異，但是急性加重高危組患者BALF中梭桿菌門豐度明顯低于低危組，而假單胞菌屬豐度明顯高于低危組。但是，基于檢測費用昂貴，我們目前完成的病例數(shù)仍較少，以后仍需進一步擴大樣本量對目前的數(shù)據(jù)進行修正確認。