內皮細胞對髓母細胞瘤干細胞特性的影響

王洪新 王玉社 王 勇△

1)河南省人民醫院 河南大學人民醫院，河南 鄭州 450003 2)河南省腦血管病醫院，河南 鄭州 450003

髓母細胞瘤是中樞神經系統惡性程度最高的神經上皮腫瘤之一，容易復發和遠處轉移。目前發現髓母細胞瘤中存在具有神經干細胞特征的腫瘤細胞，即腫瘤干細胞，它們被認為是腫瘤復發和轉移的根源[1-2]。腫瘤干細胞所處的微環境包含多種細胞因子，調節干細胞的增殖及定向分化[3-4]。如果改變腫瘤細胞的微環境，就可能改變干細胞的轉歸[5-6]。本次研究通過血管內皮細胞和腫瘤細胞共同培養以改變腫瘤細胞的微環境，觀察其對腫瘤干細胞增殖、自我更新和侵襲等方面的影響并探討其機制。

1 材料與方法

1．1材料人腦微血管內皮細胞(HBMECs)購自美國Cell Biologics公司，M199培養基購自美國Sigma公司，DMEM培養基購自Invitrogen公司，髓母細胞瘤D341細胞株由美國American Type Cell Culture提供。CD133抗體購自德國Miltenyi公司，TRIzol購自美國Invitrogen公司，Notch2抗體購自加拿大PLLABS公司，Jagged 1購自英國Abcam公司，Hes-1抗體購自美國Abbiotec公司，Hey-2抗體購自美國Millipore公司，Transwell購自Corning公司。

1．2細胞培養人腦微血管內皮細胞在20%胎牛血清(FBS)和20 mg/mL內皮細胞生長因子(ECGF)的M199培養基中培養。D341髓母細胞瘤系在加入10% FBS的DMEM培養基中培養。

1．3成球試驗將D341Med和HBMECs細胞放在孔徑0.4 μm的Transwell小室中共培養72 h，在GFP標記的D341髓母細胞瘤系中，用Leica倒置顯微鏡觀察2 000個細胞中的成球率，同時觀察二代和三代的成球率。D341Med單獨培養作對照。

1．4流式細胞儀和細胞計數收集共培養的腫瘤細胞，按試劑說明，加入1∶200的CD133抗體，然后流式細胞儀檢測CD133+的細胞數。

1．5PCR按TRIzol說明書操作提取細胞總RNA，按反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄合成cDNA。其中引物由Invitrogen公司合成，Notch2：5′-CCCAATGGGCAAGAAGTCTA-3′ and 5′-CACAATGTGGTGGTGGGATA-3′；Jagged 1：5′-CTCATCAGCCGTGTCTCAAC-3 ′and 5′-GGCACACACACTTAAATCCG-3′；Hes-1：5′-TGGATGCGGAGTCTACGATG-3′and 5′-TAAGGCCACTTGCCACCTTC-3′；Hey-2：5′-ACCTCTCTCTTGTCCCTCTCTG-3′and 5′-GGTTTATTGTTTGTTCCACTGC-3′。

1．6Western雜交試驗通過裂解液提取蛋白，采用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離生物技術，然后轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，與一抗體兔抗人Notch 2(1∶500)、Jagged 1(1∶500)、Hes-1(1∶500)、Hey-2(1∶500) 4 ℃孵育過夜；TBST洗膜3次后，加入HRP標記的羊抗兔二抗(1∶200)，室溫孵育60 min；TBST洗膜3次后，加入增強型化學發光試劑后用成像儀顯影。

1．7Transwell侵襲試驗消化、離心、計數細胞后，用無血清培養液將細胞濃度稀釋為1×105個/mL，將200 μL細胞懸液加入到已鋪好Matrigel生物膠的孔徑為8.0 μm Transwell小室內，將Transwell小室置于加入500 μL 的含10%胎牛血清培養液的24孔板中，繼續培養細胞24 h，取出小室并用10%甲醛固定30 min，結晶紫溶液染色30 min，自來水漂洗30 s后倒置顯微鏡下計數穿過基底膜的細胞數量。

1．8裸鼠成瘤試驗4周齡BALB/c裸鼠，數字隨機法分組，各組體質量、性別、周齡比例均衡。各組皮下植入腫瘤細胞(1×105個/只)，每2天用游標法測量腫瘤的長度和寬度。40 d后處死小鼠，腫瘤體積按長度(mm)×寬度2(mm2)/2計算。所有動物實驗經河南省人民醫院倫理委員會批準。

2 結果

2．1血管內皮細胞刺激髓母細胞瘤干細胞形成與D341Med組相比，D341Med+HBMECs組不僅提高了第一代髓母細胞瘤的成球能力(P<0.05)，而且第二代、第三代的成球能力也明顯提高(P<0.05)(圖1)，CD133+細胞也顯著增加(P<0.05)(圖2)。

2．2血管內皮細胞激活Notch信號通路與D341Med組相比，D341Med+HBMECs組提高了Noch 2、Jagged 1、Hes-1和Hey-2的mRNA和蛋白水平的表達(P<0.05)(圖3)。

2．3Notch信號通路對血管內皮細胞誘導腫瘤細胞干細胞的影響通過加入DAPT，以阻斷Notch信號通路，發現CD 133+細胞減少(P<0.05)(圖2)，伴隨Noch 2、Jagded 1、hes-1和hey-2的表達下降(P<0.05)(圖3)。

圖1 內皮細胞對髓母細胞瘤干細胞成球率的影響 A：第一代；B：第二代；C：第三代；*P<0.05Figure 1 Effect of ECs on the stem-like cell phenotype of MB cells in vitro.Sphere-forming assay of primary D341Med (A)，secondary generation D341Med cells (B)，and tertiary generation D341Med cells (C) cultured with or without HBMEC，*P<0.05

圖2 內皮細胞通過Notch通路對髓母細胞瘤CD133+細胞的影響 D341Med+HBMEC組與D341Med組相比，*P<0.05；D341Med+HBMEC組與D341Med+HBMEC+DAPT組相比，#P<0.05Figure 2 Effect of ECs on MB cell stemness and tumor growth via Notch in vitro.The percentage of CD133-positive cell in D341Med co-cultured with HBMEC with or without DAPT.Compared with the D341Med group，*P<0.05；compared with the D341Med + HBMEC group，#P<0.05

2．4血管內皮細胞刺激腫瘤細胞侵襲Transwell侵襲試驗顯示D341Med+HBMEC組穿膜細胞數319.56±10.67，與D341Med組(197.14±6.85)相比，差異有統計學意義(P<0.05)；與D341Med+HBMEC+DAPT(128.32±3.42)相比，差異也有統計學意義(P<0.05)。

2．5血管內皮細胞促進體內腫瘤細胞生長在體內建立異種移植瘤模型，D341Med+HBMEC組與D341Med組相比，腫瘤生長有顯著性差異(P<0.05)；與D341Med+HBMEC+DAPT相比，差異也有統計學意義(P<0.05)(圖4)。

3 討論

腫瘤干細胞周圍的微環境可通過分泌各種可溶性因子或刺激信號通路維持細胞自我更新和分化之間的平衡[7-10]。另外，它還在腫瘤的侵襲和轉移中起至關重要的作用[11-12]。打破這種異常的微環境就會削弱或加強腫瘤干細胞的自我更新，從而抑制或促進腫瘤的侵襲轉移[13-14]。

有證據表明血管內皮細胞是干細胞微環境的重要組成部分[15-16]。ZHU等[17]發現在膠質母細胞瘤中內皮細胞的一項重要功能是創造一個微環境，以促進腫瘤干細胞的自我更新。腫瘤細胞和血管內皮細胞相互作用是腫瘤增生、擴散和微轉移灶發展的重要條件之一。腫瘤細胞常位于血管周圍，而HAMBARDZUMYAN等[18]進一步研究發現髓母細胞瘤干細胞主要存在于血管旁微環境，且微環境可促進腫瘤干細胞生長和自我更新。本次實驗中腫瘤細胞和血管內皮細胞共培養后，發現髓母細胞瘤成球能力和CD133+細胞明顯增加，說明通過微環境的改變，可以改變髓母細胞瘤干細胞的行為。

關于內皮細胞對腫瘤細胞侵襲能力的影響，TRUONG等[19]建立3D器官型微流體模型以模擬三維的血管微環境，將膠質瘤干細胞和內皮細胞在模型內共同培養，可明顯增加膠質瘤干細胞的侵襲特性。本研究Transwell侵襲試驗表明D341Med+HBMEC組穿膜細胞數較D341Med組明顯增加，體內試驗顯示D341Med+HBMEC組腫瘤體積明顯增大，證實血管內皮細胞可促進腫瘤干細胞的侵襲性，而且加強了髓母細胞瘤的致瘤性。

Notch信號通路是保守而重要的經典通路之一。Notch受體有Notch1-4，配體有Jagged 1、 DLL4等，靶基因有Hes-1、Hey-2等。Notch信號系統可調控腫瘤干細胞的生長分化[20-21]，有研究發現膠質瘤干細胞可激活Notch信號促進自我更新和侵襲性[22-23]。

圖3 內皮細胞對Notch相關指標(Noch 2、Jagged 1、Hes-1和Hey-2)mRNA(A)和蛋白水平(B)的影響 D341Med+HBMEC組與341Med組相比，*P<0.05；D341Med+HBMEC組與D341Med+HBMEC+DAPT組相比，#P<0.05

圖4 內皮細胞通過Notch通路對腫瘤形態和體積的影響 D341Med+HBMEC組與341Med組相比，*P<0.05；D341Med+HBMEC組與D341Med+HBMEC+DAPT組相比，#P<0.05

免疫熒光染色顯示高水平表達Notch 1和Notch 2受體的膠質瘤干細胞位于內皮細胞附近，而內皮細胞表達Notch配體DLL4和Jagged 1，它們可通過細胞間相互接觸激活膠質瘤干細胞表面的Notch受體，促進膠質瘤干細胞自我更新[17，24]。另外，內皮細胞還可通過分泌一氧化氮激活Notch信號，從而導致膠質瘤干細胞自我更新和膠質瘤的生長[25-26]，通過γ-分泌酶抑制劑(DAPT)可抑制Notch信號，導致膠質瘤干細胞自我更新減少，同時減少了微環境中的內皮細胞[27-28]。本次實驗發現，與D341Med組相比，D341Med+HBMECs組提高了Noch 2、Jagded 1、Hes-1和Hey-2的mRNA和蛋白水平的表達(P<0.05)，證實HBMEC激活了髓母細胞瘤的Notch系統；反之，通過加入DAPT以阻斷Notch信號通路，發現CD133+細胞減少(P<0.05)，伴隨Noch 2、Jagded 1、hes-1和hey-2的表達下降(P<0.05)，提示血管內皮細胞通過激活Notch信號通路誘導髓母細胞瘤干細胞形成。而Transwell侵襲試驗顯示，D341Med+HBMEC+DAPT組與D341Med+HBMEC組相比，穿膜細胞減少(P<0.05)。體內試驗顯示前者比后者腫瘤體積明顯縮小，說明通過抑制Notch信號，可減少血管內皮細胞對髓母細胞瘤干細胞侵襲能力的影響。

本研究顯示內皮細胞和髓母細胞瘤共同培養可明顯增加髓母細胞瘤干細胞的比例，同時增加腫瘤的侵襲能力，但在應用Notch信號系統抑制劑后上述作用明顯下降，說明內皮細胞可能通過激活Notch通路促進髓母細胞瘤干細胞增殖、自我更新和侵襲能力。