EB病毒Rta優勢表位抗原的克隆表達及在應用ELISA診斷鼻咽癌中的價值

張 玲，劉 杰，王臣玉，張守信，楊麗萍，危 利，王超男，焉麗波，宋少峰，陳蒙蒙，馮曉燕，張賀秋

［1.東方海洋（北京）醫學研究院，北京 100071；2.煙臺毓璜頂醫院，山東煙臺264000； 3.艾維可生物科技有限公司，山東煙臺264000］

EB病毒（epstein-barr virus，EBV）是能普遍感染人類且與多種惡性腫瘤發病有密切關系的DNA皰疹病毒[1]。EBV相關的惡性腫瘤包括Burkitt淋巴瘤、移植后B細胞淋巴增殖性疾病、T細胞淋巴瘤、NK細胞淋巴增殖性疾病和NK細胞淋巴瘤/白血病、鼻咽癌、胃腺癌、平滑肌肉瘤等。國際癌癥研究中心1999年致癌因子的分類標準中明確將EB病毒列為第1類致癌物，尤其是鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）。NPC是第一個被發現與EB病毒感染密切相關的人類癌癥[2-3]。NPC在世界大部分地區發病率不到1/10萬，但是約80%的鼻咽癌病例在中國，尤其是廣東省，發病率高達（15～50）/10萬，每年最少有80 000例新患者，死亡率達（10～13）/10萬，成為一種區域性的高發腫瘤，因此我國已經將鼻咽癌列為重點預防和治療的惡性腫瘤之一[4]。

鼻咽癌患者一般平均在癥狀出現前三年血清EB抗體水平呈持續升高或保持高滴度，這一血清學特征有助于鼻咽癌患者進行早期篩查和診斷[5]。EBV感染后在不同的周期產生不同的抗原，立即早期蛋白Rta是病毒由潛伏期到裂解期轉變時，由立即早期基因BRLF1編碼的605個氨基酸產物，是EBV由潛伏期轉向裂解期的關鍵性調控因子，它能引起一系列的裂解早期基因的相繼表達，最終引發EBV裂解感染[6]。2012年衛生部臨床檢驗中心新增EBV Rta蛋白抗體IgG檢測項目，用于輔助鼻咽癌的早期診斷。但是，目前獲得批準的Rta-IgG抗體檢測試劑較少，難以滿足臨床需求。為此，本研究首先利用生物學軟件分析Rta氨基酸序列的B細胞表位分布及疏水性，選取含有優勢表位的抗原區段；然后進行克隆表達并初步評價了其在鼻咽癌診斷中的價值，以期能夠為Rta-IgG抗體檢測試劑研制提供關鍵原料抗原。

1 材料與方法

1.1 研究對象 50例經臨床病理確診的NPC患者血清樣本和90例健康體檢者血清樣本由煙臺毓璜頂醫院提供，保存于-80℃備用。

1.2 儀器與試劑 核酸蛋白檢測儀（上海驥輝科學分析儀器有限公司），酶標儀（Thermo公司），pBVGST-6His載體質粒為由艾維可生物科技有限公司構建并保存，T4DNA連接酶（TaKaRa公司），PrimeSTAR HS DNA聚合酶（TaKaRa公司），DNA限制內切酶（Promega公司），HRP標記的二抗（Bethyl公司）。

1.3 方法

1.3.1 Rta抗原表位分析及優勢表位抗原區段的確定：從Genebank下載EB病毒Rta蛋白的氨基酸序列，采用BIOSUN生物信息學軟件分析Rta蛋白氨基酸序列，利用B細胞表位分析功能，確定優勢表位區段。采用Godenkey軟件基因密碼子優化功能，分析Rta優勢表位抗原區段編碼基因，根據密碼子的簡并性，采用大腸埃希菌優勢密碼子替換稀有密碼子，并降低GC含量，最終確定Rta目的基因。

1.3.2 Rta優勢表位抗原基因克隆與表達：Rta目的基因的合成及序列測定由中美泰和生物技術有限公司完成。XhoⅠ和XbaⅠ雙酶切Rta目的基因及pBVGST-質粒，經連接轉化構建重組pBV-Rta。測序后，將含有正確目的基因的大腸埃希菌菌株進行誘導表達。

1.3.3 抗原純化及制備：收集誘導后的菌體，超聲破碎，從表達菌中提取包涵體，收集粗提的包涵體進行Ni柱純化。首先用平衡緩沖液（25mmol/L Tris-HCl，0.1%β-巰基乙醇，6mol/L脲，pH8.5）平衡Ni柱，將粗提的包涵體變性后過Ni柱，然后用含25mmol/L和250mmol/L咪唑的洗脫液進行洗脫，SDS-PAGE鑒定目的蛋白所在的洗脫峰。

1.3.4 間接ELISA法建立及抗原活性鑒定：純化的Rta優勢表位區段抗原pBV-Rta用碳酸鹽緩沖液稀釋，濃度為2.5μg/ml，每孔100μl，4℃過夜；用洗液洗板2次，200 μl/孔；110 μl/孔封閉液室溫封閉6 h；用洗液洗板5次，200μl/孔；每孔加入100μl樣品稀釋液后，分別加入10μl待測血清，室溫孵育30 min，洗板5次，拍干；分別加入100 μl/孔HRP標記的抗人IgG，IgA和IgM，室溫孵育20min；用洗液洗板5次，200 μl/孔，拍干；加新鮮配制的底物溶液，100 μl/孔，室溫避光孵育10 min；加入50 μl/孔2 mol/L H2SO4終止反應；A630nm/A450nm雙波長讀取吸光度A值。

1.4 統計學分析 運用GraphPad Prism 5軟件對檢測結果進行t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義，繪制ROC曲線，以約登指數最大判斷Cut off值（臨界值），≥Cut off值判定為陽性，＜Cut off值判定為陰性，并計算靈敏度與特異度。

2 結果

2.1 Rta抗原表位分析及優勢表位目的基因的確定 BIOSUN生物信息學軟件分析Rta蛋白氨基酸序列，見圖1。選取抗原性最好的301～440aa區段作為Rta優勢表位抗原區段。采用Godenkey軟件分析Rta優勢表位抗原區段編碼基因，發現其中含有25個大腸埃希氏菌表達系統稀有密碼子，所占比例為17.86%。同時Rta優勢表位抗原編碼基因的GC含量較高為61.67%，局部區段高達80%以上，影響基因的合成與擴增。因此，根據密碼子簡并性原則對其進行優化，將稀有密碼子變換為適宜在大腸埃希菌表達的優勢密碼子，并適當降低GC含量至58.09%，且不再含有局部高GC含量區域。

圖1 EB病毒Rta蛋白的B細胞表位分析

2.2 Rta優勢表位抗原表達、純化與鑒定 測序正確的重組質粒pBV-Rta轉化于大腸埃希菌誘導表達，Rta優勢表位抗原為包涵體表達，Ni柱純化后獲得純化抗原，經SDS-PAGE電泳鑒定，結果顯示Rta優勢表位抗原相對分子量約為33kDa，見圖2。

圖2 Rta優勢表位抗原SDS-PAGE電泳鑒定

2.3 Rta優勢表位抗原活性初步評價 隨機選取10份臨床病理確診的NPC患者血清樣本和10例健康體檢者血清樣本，通過間接ELISA法對其進行檢測，結果見表1。

表1 Rta優勢表位抗原活性初步評價

Rta優勢表位抗原在抗體檢測中具有非常優異的特異性，10例健康體檢者血清樣本均檢測為陰性。IgG抗體檢測優于IgA抗體檢測，可以區分NPC患者和健康對照。IgM抗體檢測NPC患者和健康對照均為陰性，無法進行區分。

2.4 NPC患者血清中Rta-IgG抗體檢測 通過間接ELISA法對50例經臨床病理確診的NPC患者血清樣本和90例健康體檢者血清樣本進行抗Rta-IgG抗體檢測，見圖3。NPC 患者血清中抗Rta-IgG水平顯著高于健康對照組（P＜0.001）。根據ROC曲線，抗Rta-IgG診斷NPC的AUC值為0.860。以約登指數最大時的A450nm=0.246為臨界值，抗Rta-IgG對NPC檢測的靈敏度為73.08%，特異度為95.79%。

圖3 Rta優勢表位抗原血清學檢測性能

3 討論

由于EBV感染與鼻咽癌密切相關，與健康成人比較，鼻咽癌患者血清中各種EBV抗體水平普遍較高，并且在鼻咽癌臨床癥狀出現之前即可檢出。但是根據我國流行病學資料，幾乎所有40歲以上的人群均感染過EBV，80%以上的健康成人是EBV攜帶者。因此用于鼻咽癌篩查和鑒別診斷的體外診斷試劑需具備高特異性，同時多靶標聯合檢測在保證特異性基礎上提高檢出率也是業內共識[7-8]。近年研究表明，聯合檢測Rta-IgG，VCA-IgA和EBNA1-IgA三種抗體能夠明顯提高臨床對NPC患者的早期篩查與診斷效能，具有重要的臨床應用價值[9]。

由EB病毒BRLF1編碼的Rta蛋白屬于立即早期蛋白，當EBV從潛伏感染轉變為裂解感染時首先啟動Rta表達，然后引發一系列級聯反應，促使病毒從潛伏狀態進入增殖狀態。由于Rta表達早，且是EBV進入裂解復制狀態必需的激活元件，所以檢測Rta抗體有助于早期發現NPC患者。為了自主研發高檢測性能的Rta抗體檢測試劑，本研究選取Rta優勢表位301～440aa，與先前研究認為Rat蛋白的表位主要位于蛋白的羧基端2/3部分（179～605aa）相一致[6,10]。該優勢表位區段與自主構建的pBVGST-6His進行連接，成功構建了原核表達質粒pBV-Rta，誘導后其為包涵體表達，Ni柱純化得到高純度的pBV-Rta抗原。pBVGST-6His載體以pBV220載體為骨架，融合了GST標簽使得目的蛋白更容易表達，同時增加了His標簽，使得目的蛋白更容易純化。此外，由于pBV220是熱誘導表達載體，在抗原規?；a時還可以降低成本。

經過小樣本驗證，確定本研究制備的Rta優勢表位抗原對IgG和IgA抗體具有高檢測性能，尤其是IgG，可以很好地區分NPC患者與健康對照血清樣本。Rta蛋白血清抗體主要有IgG和IgA，IgA抗體能反映病毒近期感染的情況，但IgG抗體的半衰期比IgA抗體更長，為保證足夠的靈敏度對于周期時間較短的立即早期蛋白應選擇IgG抗體，故目前臨床上常采用Rta-IgG抗體作為篩查指標，且一致認為血清Rta-IgG抗體是較為適合NPC初期篩查及診斷的指標之一[11-13]。

FENG等[13]研究獲得兩種原核表達的Rta重組融合蛋白質，即BRLF1-185I（187～356aa）和BRLF1-150I（384～534aa）兩個片段，并將兩種融合蛋白混合作為抗原，以間接ELISA的方法，分別檢測了51例鼻咽癌病人和47例正常對照組血清樣品中Rta-IgG，靈敏度為82.3%，特異度為85.2%。本研究僅選取一個優勢表位區段301～440aa，Rta-IgG檢測方法靈敏度和特異度分別為73.08%和95.97%，診斷性能高，特異度顯著優于文獻報道，這可能是由于該段區域為優勢表位區段抗原，含有高活性抗原表位，另一方面又去除了與人類蛋白質高度同源的區域[14]，因而具有更高的特異度。

本研究制備的Rta優勢表位抗原產量高、純度高、活性好、特異度高，基于Rta優勢表位抗原建立的Rta-IgG間接酶聯免疫檢測方法具有很好的檢測性能，為自主研發高質量Rta-IgG抗體檢測試劑奠定了基礎。