深圳地區人群乙型肝炎病毒攜帶者HLA-DRB1等位基因多態性及關聯性分析

楊小柯，何柳媚，全湛柔，高素青

（1.深圳市疾病預防控制中心，廣東深圳 518000；2.深圳市血液中心輸血醫學研究所,廣東深圳 518000）

主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）是一組編碼動物主要組織相容性抗原的基因群的統稱。人類的MHC被稱為人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA），該系統是目前已知人體最復雜的多態系統。HLA基因復合體是首個被發現的與疾病有明確關系的遺傳系統[1]。研究發現許多疾病與某些HLA等位基因或HLA單倍型呈現明顯的相關性，其中最有意義的就是HLA-B*27與強直性脊柱炎的相關性[2-6]。HLA的大部分基因和免疫系統相關，特別是II類區域幾乎所有基因均顯示免疫相關功能[7]。乙肝病毒（hepatitis B virus,HBV）感染后表現出的不同疾病過程取決于個體的免疫反應狀況，眾多流行病學調查資料表明，HBV感染與宿主的種族、免疫狀態和遺傳因素有關。而HLA直接參與免疫反應。其中，HLA-II類分子主要分布在抗原呈遞細胞(APC)和T淋巴細胞表面。CD4+T淋巴細胞表面上的TCR受體識別HLA-II類分子并與提呈的抗原肽結合，是啟動CD4+T淋巴細胞免疫活化的關鍵步驟。活化的CD4+T淋巴細胞可分泌促細胞毒性T淋巴細胞（CTL）生長與分化的淋巴因子，激活CTL和自然殺傷細胞（NK細胞），參于抗HBV的應答。HLA-DRB1是經典的HLA-II類基因。既往對乙肝病毒攜帶者中的HLA多態性的分析研究多采用血清學方法[8]，聚合酶鏈反應-直接測序分型法（PCR-SBT）是如今研究的主流技術。深圳地區HLA-DRB1與HBV攜帶者的相關性至今尚未見有報道，筆者所在實驗室對HLA-DRB1基因多態性與乙型肝炎病毒攜帶者之間的相關性進行了研究。

1 材料與方法

1.1 研究對象 以無癥狀的163例深圳地區漢族人群乙型肝炎病毒攜帶者作為研究對象（年齡為18～60歲，酶聯免疫法和核酸轉錄介導擴增技術兩種方法檢測乙型肝炎表面抗原均為陽性），正常對照組為隨機抽取的314例無血緣關系的深圳地區健康漢族人群（年齡18～60歲，酶聯免疫法和核酸轉錄介導擴增技術兩種方法檢測乙型肝炎表面抗原均為陰性，無其它病毒性肝炎、自身免疫性疾病等）。攜帶組和對照組參與者均對實驗知情同意，并經深圳市血液中心醫學倫理委員會批準。

1.2 儀器與試劑 全自動核酸提取儀（MagCore HF16，臺灣瑞寶公司），PCR儀（9700型，美國ABI公司），測序儀（3730型，美國ABI公司），核酸提取試劑（臺灣瑞寶公司），HLA基因測序分型試劑（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.3 方法

1.3.1 使用全自動核酸提取儀（MagCore HF16，臺灣瑞寶公司）和提取試劑（臺灣瑞寶公司）提取外周血白細胞中基因組DNA，DNA濃度在20～100ng/ml，純度在1.6～2.0。

1.3.2 采用商品化測序分型試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司），按試劑盒說明書先進行擴增、擴增產物純化，再進行測序反應、測序反應產物純化，最后用測序儀（3730型，美國ABI公司）進行毛細管電泳。收集原始數據后，使用uTYPE7.2版（HLA SBT uTYPE 7.2CMDP）軟件分析，并最終得到攜帶組和對照組的HLA-DRB1基因分型結果。

1.4 統計學分析 采用直接計數法計算攜帶組和對照組的HLA-DRB1等位基因頻率，結果進行Hardy-Weinberg吻合度檢驗。兩組間等位基因頻率比較采用SPSS Statistics 20統計軟件（IBM公司）進行χ2檢驗。

2 結果

攜帶組和對照組的HLA-DRB1等位基因觀察值與期望值差異無統計學意義，基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律。乙肝病毒攜帶組及健康對照組的HLA-DRB1等位基因頻率分布見表1。可見，對照組檢出的HLA-DRB1等位基因有32種，其中占比大于5%的基因型有6種，為HLADRB1*09:01（16.40%），12:02（11.15%），15:01（9.87%），08:03（8.91%），11:01（6.05%），04:05（5.10%）；攜帶組中檢出的HLA-DRB1等位基因有28種，其中占比大于5%的基因型有6種，為HLA-DRB1*09:01（20.55%），12:02（14.72%），15:01（9.20%），03:01（7.06%），08:03（5.52%），11:01（5.21%）。其中，攜帶組中HLA-DRB1*03:01檢出率高于對照組，差異有統計學意義（P=0.010）。

3 討論

HBV是引起乙型肝炎的病原體，HBV感染是全球性的公共衛生問題。我國人群具有特殊的肝病背景，HBV攜帶者在人群中比例高達10%。HBV的發病原因、感染控制等一直是科研工作的熱點。

機體抗病毒免疫功能及病毒逃避免疫攻擊的能力決定著HBV感染的發生、發展和轉歸[9]。ZENIYA等[10]通過研究認為免疫遺傳背景是決定HBV感染疾病易感性的重要因素之一。HLA基因多態性影響著免疫應答和抗原遞呈，從而導致機體免疫功能狀態的差異。某些特殊的HLA基因型可能影響著HBV感染的慢性化和免疫反應的強弱[11-13]，從而導致HBV感染后結局的不同。HLA-II類抗原主要分布于B細胞，抗原呈遞細胞和激活的T細胞表面，參與呈遞外來抗原給CD4+T細胞（MHC限制）[14]。WEISSMAN等[15]認為造成無應答狀態的原因與攜帶有關HLA基因者難以將HBsAg信息提呈給T細胞，并產生抗體有關。HLA-II類分子中HLA-DRB區的多態性最為復雜[16]。近年來，國內外學者對HLA-DRB1基因多態性和不同疾病關系的研究相對較多。ZHU等[17]發現HLA-DRB1等位基因對湖北漢族人群腎綜合征出血熱有影響；FAINBOIM等[18]的研究認為DRB1*13:01與慢性甲肝感染密切相關；SHI等[19]通過實驗得出HLADRB1*15與中國北方漢族人群肺結核相關的結論；THURSZ等[20]對岡比亞人群的研究表明，HLADRB1*13:02與HBV感染的自發清除有關，可能對機體抗HBV感染具有保護作用，隨后這一結果在韓國[21]、德國[22]以及高加索[23]人群的研究中陸續得到證實。但是國內針對HBV與HLA-DRB1的研究卻顯示出了不同的結果，山東的袁俊華[24]發現HLA-DRB1*12:01/15:01可能是慢性乙型肝炎HBV攜帶者的易感基因；宋明勝等[25]的研究結果顯示HLA-DRB1*04:01為HBV慢性感染的一個易感基因；邢文斌等[26]研究發現HLA-DRB1*13:01與乙型肝炎病毒的清除有關，HLA-DRB1*07:01，03:01，02:01與乙型肝炎病毒慢性感染有關。

表1 乙肝病毒攜帶組與健康對照組HLA-DRB1等位基因的數量及頻率分布檢出數[頻率(%)]

不同人種、不同地區人群的HLA基因存在很大差異，深圳地區人群HLA-DRB1與HBV攜帶者的相關性至今尚未見有報道，為探討深圳地區人群對HBV的易感性是否與HLA-DRB1等位基因有關，本研究選取HBV攜帶者（攜帶組）和健康人群（對照組）進行HLA-DRB1基因檢測并進行統計學分析，結果顯示，攜帶組中HLA-DRB1*03:01檢出率高于對照組，差異有統計學意義（P=0.010）。提示深圳地區人群感染乙肝病毒的機會與HLADRB1*03:01呈正相 關，HLA-DRB1*03:01可 能是乙肝病毒的易感基因。此結果與錢燕華等[27]用Meta分析的方法綜合評價9篇病例對照研究文獻后得出的結論一致，即HLA-DRB1*03等位基因與我國漢族人群慢性乙型肝炎的發生具有顯著的統計學關聯，為易感基因。

HLA-DRB1*03:01等位基因與免疫相關疾病的關系已被多個研究證實[28-30]，本研究結果說明，HLA-DRB1*03:01等位基因與HBV感染亦存在關聯。HLA-DRB1*03:01在HBV感染后是如何發揮免疫學方面作用的，是否要對攜帶此基因的人群增強HBV抗感染免疫，還有待于進一步的研究。