廣西壯族自治區人群華支睪吸蟲感染與MN血型基因的相關性研究

唐雄馳，徐慶萍，韋小榮，黃克河，江 毅，施超園，梁延連

（1.貴港市平南區人民醫院，廣西貴港 537300；2.廣西醫科大學附屬武鳴醫院；南寧 537000； 3.深圳市血液中心輸血醫學研究所,廣東深圳 518000）

華支睪吸蟲（又稱肝吸蟲，以下統稱華支睪吸蟲）的感染與流行是中國南方地區關注的流行病，其中以廣西、廣東和海南等省(自治區)為華支睪吸蟲病的主要流行區。華支睪吸蟲又稱華肝蛭，成蟲寄生于人體的肝膽管內，對人的肝膽管造成病變損害，蟲體主要攝取宿主的紅細胞與白細胞。成蟲在肝膽管內破壞膽管上皮及黏膜下血管并不斷排出代謝產物和分泌有毒物質，引起膽管內膜及膽管周圍的超敏反應與炎癥反應，出現膽管局限性的擴張及膽管上皮增生，由于膽管壁增厚，管腔狹窄和蟲體堵塞膽管，可出現膽管炎與膽囊炎或阻塞性黃疸，

由于膽汁流通不暢，往往容易并發細菌感染。華支睪吸蟲的幼蟲在肝實質移行或在腹腔器官內移行時會刺激宿主肌體產生炎癥應答，激發免疫應答產生IgM與IgG抗體。病理研究表明，受華支睪吸蟲感染的膽管呈腺瘤樣病變，感染嚴重時在門脈區周圍可出現纖維組織增生和肝細胞的萎縮變性，甚至形成膽汁性肝硬化。廣東、廣西等地區的人群均有喜歡吃“魚生”或“生滾魚粥”的生活習慣，生吃海鮮有感染華支睪吸蟲的危險[1]。有研究報道：人類的細胞因子與寄生蟲感染息息相關，細胞因子是機體受內、外刺激而產生的免疫遞質，它們既是免疫細胞的效應分子，又是細胞間傳遞信息、相互調節的分子通路[2]。與寄生蟲相關的細胞因子主要包括白細胞介素群系（IL-1，IL-2，L-3……）、干擾素群系（IFNα，β，γ）、腫瘤壞死因子群系與轉化生長因子等，其中細胞黏附分子屬于跨膜糖蛋白，

這類型的跨膜糖蛋白是寄生蟲感染的受體[3-4]。另外有報道：華支睪吸蟲病人有紅細胞免疫功能方面明顯低下的癥狀，但體液免疫功能無明顯改變[5]。據此，本研究對有相同飲食習慣的廣西壯族自治區武鳴區與貴港平南區的15～65歲人群進行了隨機篩查血清中華支睪吸蟲IgG抗體，同時對寄生蟲感染有密切關系的紅細胞跨膜糖蛋白候選基因M，N，MG，MT的頻率進行了調查研究，報道如下：

1 材料與方法

1.1 研究對象 樣本來源以廣西壯族自治區具有相同飲食習慣（生吃魚肉）的武鳴區與貴港平南區作為代表性研究地區，隨機抽選15～65歲原居住地人群，其中武鳴區700例，貴港平南區500例，共1 200例。分別采集3ml不抗凝血與3ml抗凝全血進行血清華支睪吸蟲IgG抗體檢測與紅細胞跨膜糖蛋白相關候選基因M，N，MG，MT的頻率調查。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑：由深圳華康生物醫學工程有限公司生產的華支睪吸蟲IgG抗體檢測試劑盒（批號：20191103），定性檢測人血清（漿）中特異性華支睪吸蟲IgG抗體，抗體水平與感染水平呈正相關。單克隆鼠抗血清Anit-M(IgM性質，批號：20190709)，Anit-N(IgM性質，批號：20190428)均由上海血液生物科技有限責任公司提供，進行MN血型鑒定并統計M，N基因頻率。Gentra DNA提取試劑盒（批號：106412）由美國Promega公司提供。基因測序選用引物[6]：上游：5’-CCACATAGCAATTCTCTAAAC-3’；下游：5’-GCATTTCTCAGTGTTTGTCAC-3’進行MG，MT基因分型與頻率調查。

1.2.2 儀器：Vranus AE120酶聯免疫分析儀，Eppendorf 9700 PCR擴增儀，PrismTMABl3730XL測序儀，Embitec電泳儀，D77WWL-20-M凝膠成像儀，Diamed-ID 12SI卡式離心機，Diamed-ID 37SI孵育器。

1.3 方法

1.3.1 血清華支睪吸蟲IgG抗體檢測：實驗方法與結果的判斷嚴格按試劑盒的步驟與要求進行。MN血型鑒定以血型血清學的抗原-抗體反應檢測MM，MN，NN血型結果，同時計算M，N的基因頻率。

1.3.2 DNA提取：使用Gentra試劑盒提取抗凝血樣的DNA，并控制DNA的濃度在80～100ng/μl范圍。

1.3.3 PCR加樣體系與擴增條件：50μl加樣體系：10×Buffer 5μl；MgCl23μl；dNTP 4μl；正 向 與反向引物各2μl；TaqDNA聚合酶1μl；DNA模板2μl；ddH2O 31μl。擴增條件：94℃預變性5 min；94℃×1 min，56℃×1 min，72℃×1 min，共30個循環；72℃延伸5 min，4℃保存。

1.3.4 擴增產物驗證：取3μl擴增產物經2 g/dl瓊脂糖凝膠電泳鑒定目的片段與產物的純度。

1.3.5 產物純化與測序鑒定：使用離心過濾柱法(Milliprore公司)純化擴增產物，純化后的擴增產物作為測序反應模板，再一次擴增，測序引物與第一次擴增引物序列相一致，采用10μl反應體系：正向與反向引物(終濃度為0.062 5pmol/L)各3μl；模 板DNA 1μl；ddH2O 2.0μ1；ABI Big-Dyev3.1測序反應液4μ1。PCR擴增條件：94℃預變性10min；94℃變性10s，50℃退火5s，60℃延伸4min，運行25個循環后產物于4℃保存。以上擴增產物用醋酸鈉/乙醇沉淀法提純后使用PrismTMABl3730XL基因測序儀檢測，并使用Oli6instatler分析軟件進行測序結果分析。

2 結果

通過Vranus AE120酶聯免疫分析儀對廣西壯族自治區隨機選取的武鳴區700例、貴港平南區500例共1 200例15歲至65歲人群的華支睪吸蟲血清抗體檢測，得到華支睪吸蟲IgG抗體篩查結果：武鳴區的華支睪吸蟲抗體陽性率62.7%（439/700），貴港平南區的華支睪吸蟲抗體陽性率3.4%(17/500)，這說明兩個區的華支睪吸蟲感染陽性率具有明顯差異。對1 200例人群的血樣全部進行了紅細胞跨膜糖蛋白候選基因M，N，MG，MT頻率調查，見表1。從相關的基因調查暫時未發現與兩區人群的華支睪吸蟲感染有顯著差異。MG，MT基因分型鑒定代表圖見圖1,圖2。

表1 廣西壯族自治區武鳴區與貴港平南區的華支睪吸蟲感染調查結果

圖1 MG血型基因鑒定位點

圖2 MT血型基因鑒定位點

應用相同的試劑與檢測儀器同時對武鳴區與貴港平南區人群的華支睪吸蟲抗體檢測結果顯示，兩個地區的人群都習慣食用“魚生”或“生滾魚粥”等生吃海鮮的習慣，但兩地區的華支睪吸蟲感染程度具有明顯的不同，武鳴區的人群對華支睪吸蟲感染具有高發的現象，而貴港平南區的人群對華支睪吸蟲是低感染的現象，說明人群對華支睪吸蟲的易感性未必與飲食習慣完全相關。另外，檢測兩地區人群的紅細胞跨膜糖蛋白候選基因M，N，MG，MT基因頻率未發現明顯差異。

3 討論

據調查研究發現，在亞熱帶地區生活的人群普遍都有一個共同的生活習慣：食用生的或烹飪未完全煮熟的淡水魚。大部分淡水魚類中攜帶有一種名為Clonorchis sinensis的蠕蟲，這種蠕蟲稱華支睪吸蟲，又稱肝吸蟲（liver fluke），它的成蟲寄生于人或動物體的肝膽管內，可引起華支睪吸蟲病（Clonorchiasis），又稱肝吸蟲病。受華支睪吸蟲（以下統稱華支睪吸蟲）感染的人類或動物會表現出生長遲緩和各種并發性疾病：肝臟大量出血和炎癥，膽管和膽囊增厚或擴張，較為嚴重的并發癥是誘發肝臟發生惡性腫瘤[7-8]。當寄生蟲初步感染時，會刺激肌體最先免疫出現的是IgM抗體，隨著感染時間的延長會出現IgG抗體，如果在血清中檢測到寄生蟲的IgG抗體，說明肌體有曾經的感染史或正在感染華支睪吸蟲。因此通過血清學檢測的定性方法，可以追蹤與定性華支睪吸蟲的感染率。

研究中對我國南方地區具有相同喜好：吃“魚生”或“半生魚粥”生活習慣的廣西壯族自治區武鳴、貴港兩區進行華支睪吸蟲的高發感染與低感染人群的頻率與相關候選基因進行調查研究，以隨機選取的方式對武鳴區700例、貴港平南區500例共1 200例的15～65歲人群進行華支睪吸蟲抗體IgG抗體篩查，嚴格按照試劑盒說明書的操作進行血清抗體檢測，每批次實驗均設置陰性、陽性、空白對照孔，結果顯示武鳴區的華支睪吸蟲抗體陽性率為62.7%，貴港平南區的華支睪吸蟲陽性率為3.4%。從數據上體現了具有相同飲食習慣的地區在華支睪吸蟲的易感性上具有顯著的差異。調查對像不分男性與女性，只選取15～65歲的人群，原因是同一地區或同一家庭中飲食相似，這個年齡段的人活動范圍廣、餐中食量大等共同特點。根據兩區人群的高發感染與低感染率的差異，是否與不同地區人群的其他遺傳基因相關有待進一步的深入研究。對于華支睪吸蟲感染的研究，除了血清學檢測已經被廣泛應用外，人們逐步建立起標準化、準確性高的診斷測試來識別是否受感染，還有通過分子生物學技術在基因識別和表征來鑒別感染與致病的可能性，并且把分子生物學手段介入了寄生蟲的治療：Wannaporn Ittiprasert動物模型中，使用CRISPR/Cas9‘敲除’的基因導致寄生蟲感染癥狀顯著減少，通過他們的研究還表明，這種革命性的生物醫學工程-CRISPR/Cas9是一項新技術，可以精確定位和滅活寄生蟲所產生的特定蛋白質所需的遺傳信息[9]。另外在華支睪吸蟲感染與治療方面，可以使用CRISPR/Cas9去除編碼顆粒體的基因，使華支睪吸蟲感染的癥狀明顯減輕[9]。廣西壯族自治區武鳴與貴港平南兩區人群的寄生蟲感染相關的紅細胞跨膜糖蛋白候選基因：M，N，MG，MT基因的頻率分布結果未發現該基因與華支睪吸蟲感染密切相關，有待增加樣本量深入鑒定寄生蟲感染受體-紅細胞跨膜糖蛋白對應的相關基因的堿基序列，以期深入了解華支睪吸蟲對人群的易感性與耐受性。

研究發現，大部分的淡水魚體內感染了華支睪吸蟲，但蝦類都不感染華支睪吸蟲[10]。所以調查喜食“魚生”或“生滾魚粥”的廣西壯族自治區武鳴與貴港平南區人群，得到的調查結果與別的地區報道有差異：中山市居民人群華支睪吸蟲總感染率為19.45%[11]；佛山市華支睪吸蟲感染率為33.89%[12]。調查結果顯示廣西武鳴區感染率與同樂鄉（77.85%）較為相近[13]。從數據說明，我國各個地區的人群對華支睪吸蟲的感染情況各有差異，文獻報道的研究結果大多以人群的生活習慣：生食魚類或其他海鮮類的原因確定為易感因素。然而，在不同居住地但有相同飲食習慣的廣西壯族自治區武鳴區與貴港平南兩區的人群存在高發率與低感染率的明顯差異，這是否與人群中不同的基因或血液中的黏附因子相關有待進一步深入研究，這項展望也是課題下一步探討的方向，研究結果可以為華支睪吸蟲的預防與治療打下基礎。