胃腸手術(shù)患者瑞芬太尼相關(guān)基因位點(diǎn)檢測(cè)在術(shù)中麻醉藥物劑量評(píng)估中的應(yīng)用

胡玉皎，張 瑩，周鐵成，王 昊，成丹丹，郝曉柯，劉家云

（空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院a.全軍臨床檢驗(yàn)中心；b.麻醉科,西安710032）

瑞芬太尼（remifentanil，REM）可用于全身麻醉（general anesthesia，GA）誘導(dǎo)和術(shù)中維持鎮(zhèn)痛，麻醉起效快，作用持續(xù)時(shí)間短，對(duì)患者各項(xiàng)血液動(dòng)力學(xué)指標(biāo)影響較小，是目前最常使用的麻醉藥物[1]。麻醉藥物經(jīng)呼吸道吸入、靜脈或肌肉注射進(jìn)入體內(nèi)后產(chǎn)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制，其不良反應(yīng)和副作用與中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制程度和血液內(nèi)藥物濃度有關(guān)[2]。本研究通過(guò)采用熒光探針原位雜交法（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH），使用數(shù)字化熒光檢測(cè)儀對(duì)消化外科胃腸手術(shù)患者瑞芬太尼麻醉藥物相關(guān)基因耐藥位點(diǎn)OPRM1(118A＞G)，CYP3A4*1G(25343C＞T)，ABCB1(3435T＞C)，CYP3A4*18B(A＞G)進(jìn)行檢測(cè)，旨在根據(jù)患者不同基因型，分析其藥物作用和代謝特性，指導(dǎo)患者合理用藥，達(dá)到提高藥效、降低毒性和減少不良反應(yīng)發(fā)生的效果，為手術(shù)患者麻醉藥物的使用提供精準(zhǔn)的個(gè)體化用藥指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2017年1月～2019年12月在本院消化外科接受麻醉藥物瑞芬太尼耐藥位點(diǎn)OPRM1(118A＞G)，CYP3A4*1G (25343C＞T)，ABCB1(3435T＞C)，CYP3A4*18B(A＞G)檢測(cè)的胃腸手術(shù)患者5 249例，所有受檢患者均順利完成手術(shù)麻醉，其中食管手術(shù)759例，平均年齡59.02±11.86歲，男性478例，女性281；胃部手術(shù)2 613例，平均年齡58.17±12.48歲，男性1 983例，女性630例；腸道手術(shù)1 877例，平均年齡57.97±12.25歲，男性1 094例，女性783例。

1.2 儀器和試劑

1.2.1 儀器：TL998A熒光檢測(cè)儀（西安天隆公司）；Flutec 48E微量熒光檢測(cè)儀（西安天隆公司）。

1.2.2 試劑：10×NH4Cl預(yù)處理液，用注射滅菌水按9∶1比例稀釋為1×NH4Cl工作液，用于樣本前處理時(shí)裂解紅細(xì)胞；軟件設(shè)定液：用于反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備；核酸純化試劑（耀金保），用于檢測(cè)分析前保存樣本；測(cè)序反應(yīng)通用試劑盒（耀金分），用于熒光原為雜交、數(shù)字化熒光檢測(cè)基因型分析。以上試劑均購(gòu)自北京華夏時(shí)代基因公司。

1.3 方法

1.3.1 采集血樣：于EDTA抗凝管中，采集患者靜脈血2ml，室溫放置，24 h內(nèi)完成檢測(cè)。

1.3.2 富集白細(xì)胞樣本：取200μl全血標(biāo)本加入1.5ml離心管中；加入1.0ml 10×NH4Cl預(yù)處理液，漩渦混勻，室溫靜置5min，待紅細(xì)胞完全裂解、液體顏色變?yōu)橥噶良t色后3 000r/min離心5 min，棄去上層液體，重復(fù)該步驟一次。加入30μl核酸純化試劑，漩渦混勻，室溫靜置60 min。

1.3.3 樣本檢測(cè)：完成前處理的樣本分別加入含有OPRM1，CYP3A4*1G，ABCB1和CYP3A4*18B探針的測(cè)序反應(yīng)試劑，用TL998A熒光檢測(cè)儀、Flutec 48E微量熒光檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)并判讀結(jié)果。

1.3.4 質(zhì)量控制：每次實(shí)驗(yàn)加陽(yáng)性對(duì)照(陽(yáng)性質(zhì)控品)及陰性對(duì)照(核酸純化試劑)，用來(lái)監(jiān)測(cè)檢測(cè)系統(tǒng)和試劑是否有效，以及樣本處理過(guò)程中是否存在污染。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 收集、記錄各組數(shù)據(jù)，使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)變量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較用t檢驗(yàn)，不同基因型之間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究組基因型分布 見(jiàn)表1。食管、胃部、腸道手術(shù)患者組OPRM1基因型分布（χ2=1.83，P＞0.05），CYP3A4*1G基因型分布（χ2=2.17，P＞0.05），ABCB1基因型分布（χ2=8.01，P＞0.05），差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。三個(gè)患者組CYP3A4*18B基因分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2=100.29，P＜0.01)，故食管、胃部、腸道手術(shù)患者組CYP3A4*18B基因分布不同。

表1 食管、胃部、腸道手術(shù)患者OPRM1，CYP3A4*1G，ABCB1基因型分布頻率[n(%)]

2.2 基因型分布頻率及術(shù)中瑞芬太尼用量 見(jiàn)表2。OPRM1，CYP3A4*1G，ABCB1基因型分布頻率與術(shù)中瑞芬太尼用量的關(guān)系，OPRM1(118A＞G)GG基因型患者與AG，AA基因型相比，需要較高劑量緩解疼痛[3]；CYP3A4*1G(25343C＞T)TT基因型患者藥物酶代謝活性低，應(yīng)降低藥物使用劑量、減慢靜脈泵注速度才可避免副作用的發(fā)生[4]；ABCB1(3435T＞C) TT基因型較CT/CC患者對(duì)瑞芬太尼應(yīng)答較好，可低劑量慢速給藥[5]。

表2 OPRM1，CYP3A4*1G，ABCB1基因型分布頻率及瑞芬太尼用量

2.3 基因型與瑞芬太尼劑量和泵速的關(guān)系 本研究中OPRM1 AA/AG，CYP3A4*1G TT,ABCB1 TT基因型患者共54例，麻醉過(guò)程中應(yīng)減低瑞芬太尼劑量，嚴(yán)格控制靜脈泵注速度；118例OPRM1 GG，CYP3A4*1G CC，ABCB1 CC基因型患者，術(shù)中麻醉維持中根據(jù)其麻醉程度適當(dāng)提高瑞芬太尼劑量和泵注速度；100例CYP3A4*18B AG/GG基因型患者適當(dāng)減少瑞芬太尼劑量，降低靜脈泵注速度。由于CYP3A4*18B AG/GG基因型患者人群中占比1.91%，故表2中未納入該等位基因型別，當(dāng)遇到該基因型患者時(shí)適當(dāng)減少瑞芬太尼劑量，降低靜脈泵注速度[6]。

3 討論

瑞芬太尼為超短效μ型阿片受體激動(dòng)劑，其鎮(zhèn)痛作用及副作用呈劑量依賴性，關(guān)于麻醉藥物瑞芬太尼耐藥位點(diǎn)的研究顯示，由μ-阿片受體基因（OPRM1）編碼的μ-受體是大多數(shù)內(nèi)源性和外源性阿片物質(zhì)作用的主要靶點(diǎn)，因此OPRM1也是藥物遺傳差異的主要候選基因[7]，達(dá)到同樣的鎮(zhèn)痛效果，攜帶OPRM1(118A＞G)G等位基因的患者會(huì)消耗更多的阿片類藥物[8]。根據(jù)本研究基因位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果評(píng)估瑞芬太尼預(yù)期藥量結(jié)合臨床實(shí)際用藥，表明OPRM1(118A＞G)GG基因型患者較AA/AG基因型需更高劑量才能達(dá)到鎮(zhèn)痛效果。

細(xì)胞色素P450酶（cytochromeP450，CYP450）在肝臟和腎上腺微粒體中含量豐富，是主要的藥物代謝酶，其基因多態(tài)性參與阿片類藥代謝的一相反應(yīng)，對(duì)藥物的吸收、代謝及口服藥的首過(guò)消除都有重要作用[9]。CYP3A4基因是 CYP450超家族中表達(dá)最為豐富的酶，CYP3A4酶活性為單態(tài)分布，其機(jī)體內(nèi)含量或活性改變均可引起藥物的代謝動(dòng)力學(xué)或藥效學(xué)改變，從而產(chǎn)生個(gè)體差異[10]。阿片類藥物主要在肝臟和小腸內(nèi)由CYP3A4酶代謝成幾乎無(wú)活性物質(zhì)，CYP3A4*1G及CYP3A4*18突變可以改變CYP3A4酶的活性，因此與術(shù)后鎮(zhèn)痛效應(yīng)相關(guān)[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，CYP3A4*1G(25343C＞T)TT基因型腹部手術(shù)患者術(shù)后48h阿片類藥物用量明顯低于CC型患者（20%～40%）[12]，提示CYP3A4*1G基因多態(tài)性是引起術(shù)后阿片類藥物鎮(zhèn)痛效應(yīng)個(gè)體差異的主要遺傳因素[13]。另有報(bào)道，對(duì)于胃切除術(shù)后患者，CYP3A4*18B(A＞G)GG基因型患者，可使用較低劑量的阿片類藥物，而對(duì)于AA患者，則需使用較高劑量[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，CYP3A4*1G(25343C＞T)TT型基因患者和CYP3A4*18B(A＞G)GG基因型患者消耗瑞芬太尼少于野生型患者。

P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gP）是ABCB1 (MDR1)編碼的一種分子量170KD的跨膜糖蛋白，既能與藥物結(jié)合，又能與ATP分子結(jié)合，具有能量依賴性“藥泵”外排的作用，P-gP減低了細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，使細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性[15]。研究證明術(shù)后患者ABCB1基因多態(tài)性，與許多藥物的體內(nèi)代謝相關(guān)，會(huì)影響阿片類藥物的使用劑量[16]。此外，吳成鳳等[17]人報(bào)道，ABCB1基因T等位基因攜帶者所需阿片類藥物使用量顯著減少，可能與ABCB1基因C3435T多態(tài)性影響了阿片類藥物進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的能力有關(guān)。本次研究發(fā)現(xiàn)，ABCB1(3435T＞C)TT基因型患者，使用阿片類藥物劑量明顯低于CC基因型患者，與文獻(xiàn)報(bào)道相符[18]，提示TT型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性減弱，阿片類藥物外排能力減弱，藥物應(yīng)答更為敏感。

隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)及藥物個(gè)體化治療的發(fā)展進(jìn)步，檢測(cè)技術(shù)和手段日益更新?lián)Q代，熒光探針原位雜交技術(shù)其原理是將熒光素（或生物素、地高辛等）直接或間接標(biāo)記的核酸探針與待測(cè)樣本中的核酸序列按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)而進(jìn)行定性、定量分析，具有靈敏度高、試驗(yàn)周期短、操作安全、被污染幾率小、對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求低等優(yōu)勢(shì)。將熒光探針原位雜交技術(shù)用于手術(shù)患者麻醉藥物使用的評(píng)估中，充分了解麻醉藥物基因組學(xué)的基本原理，掌握用藥的個(gè)體化原則，根據(jù)病人的不同基因型的特性進(jìn)行合理用藥，以達(dá)到提高藥效、降低毒性和防止不良反應(yīng)發(fā)生的目的。