2型糖尿病患者錳超氧化物歧化酶Ala-9Val基因多態(tài)性與頸動脈粥樣硬化的相關性研究

何曉一，李春燕(中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九八七醫(yī)院.內分泌科；.消化內科,陜西寶雞 721000)

頸動脈粥樣硬化(carotid atherosclerosis,CAS)是2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)患者最常見的大血管并發(fā)癥，亦是導致T2DM患者死亡的主要原因，因此有效控制頸動脈粥樣硬化（Carotid atherosclerosis CAS）對改善T2DM患者的預后和生活質量具有積極的作用。研究結果表明氧化應激水平的異常在糖尿病發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用[1-3]。錳超氧化物歧化酶(manganesesuperoxide dismutase,Mn-SOD)是超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的同工酶，其是機體重要的抗氧化酶之一，近年來有研究指出Ala-9Val是Mn-SOD基因多態(tài)性位點，該位點基因型差異可直接影響Mn-SOD構象及生物學活性。目前已有大量關于Ala-9Val位點單核苷酸多態(tài)性(single nucleotid e polymorphism,SNP)與糖尿病、糖尿病視網膜病變、糖尿病腎病等相關性分析的文獻報道[4-6]，但是鮮有其SNP與CAS相關性的研究報道，基于此本研究通過比較不同患者Mn-SOD基因Ala-9Val位點基因型和等位基因分布頻率的差異，旨在探討Mn-SOD基因多態(tài)性與T2DM及CAS的相關性，為臨床提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取我院2017年1月～2019年1月310例T2DM患者為T2DM組，其中男性181例，女性129例；平均年齡56.09±9.81歲，根據頸動脈超聲檢查結果又分為無CAS亞組和CAS亞組。另選取同期我院體檢健康的160例志愿者作為對照組，其中男性94例，女性66例；平均年齡55.74±9.90歲。本研究經我院倫理委員會審核批準，所有受試者均自愿參加且簽署知情同意書。

收集受試者的一般資料，主要包括體重指數(body mass index,BMI)、高血壓病史、空腹血糖(fasting plasma glucose,FPG)、糖化血紅蛋白(glycated hemoglobin,GHb)、三酰甘油(triacylglycerol,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)等。

T2DM組納入標準：①年齡≥18歲；②嚴格參照中華醫(yī)學會糖尿病學分會指定的《中國2型糖尿病防治指南》(2013年)診斷為T2DM者[7]；③糖尿病病程大于5年者。

T2DM組排除標準：①1型糖尿病者；②并發(fā)嚴重肝腎疾病、惡性腫瘤和風濕免疫系統(tǒng)疾病者；③妊娠期女性。

1.2 儀器與試劑 DNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，PCR儀購自德國Eppendorf公司。采用日本東芝公司智能彩色多普勒超聲儀(Aplio 500型)測定頸動脈內中膜厚度值(carotidintimamedia thickness,CIMT)。

1.3 方法 頸動脈超聲檢查：受試者取仰臥位，采用智能彩色多普勒超聲儀檢測頸總動脈分叉處及分叉處遠端和近端各1～1.5cm處的CIMT值，取左右兩側較大值作為該受試者CIMT結果。本研究定義CIMT≥1mm或頸動脈斑塊形成為CAS，并以此標準將T2DM組患者分為無CAS亞組和CAS亞組。

基因多態(tài)性檢測：①基因組DNA提取：清晨采集受試者空腹外周靜脈血3 ml，采用DNA提取試劑盒嚴格按照說明書上的操作步驟提取全血基因組DNA。②PCR擴增：嚴格按照PCR操作流程，上、下游引物分別為5’-CAGCCCAGCCTGCGTAGACG-3’；5’-GCGTTGATGTGAGGTTCCAG-3’。③酶切和電泳：取延伸產物采用限制性內切酶BsaW Ⅰ進行酶切，再取酶切產物進行電泳，凝膠成像系統(tǒng)判定結果。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，計數資料以n（%）表示。基因型分布采用Hardy-Weinberg平衡定律檢驗。多因素分析采用Logistic回歸分析法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組間一般資料的比較 見表1。相較于對照組，T2DM組患者的CIMT，F(xiàn)PG和LDL-C值均顯著升高，其差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，兩組的BMI，吸煙、高血壓、GHb，TG，TC和HDL-C差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。另外，相較于無CAS亞組，CAS亞組患者的CIMT，GHb，TG和TC均顯著升高，其差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，兩組的BMI，吸煙、高血壓、FPG，LDL-C和HDL-C差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

2.2 各組Mn-SOD基因Ala-9Val位點基因型和等位基因分布頻率的比較 見表2。研究發(fā)現(xiàn)在Mn-SOD基因Ala-9Val位點共有3種基因型，分別為Val/Val，Ala/Val和Ala/Ala基因型。對照組和T2DM組的Ala-9Val位點基因型差異無統(tǒng)計學意義(χ2=4.210，P=0.122)，兩組的等位基因分布頻率差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=4.487，P=0.034)。CAS亞組與無CAS亞組的Ala-9Val位點基因型和等位基因分布頻率差異均具有統(tǒng)計學意義(χ2=12.283，P=0.002；χ2=10.984，P=0.001)。

2.3 T2DM患者發(fā)生CAS的危險因素分析 見表3。結合上述實驗結果，以GHb，TG，TC和Ala-9Val位點Val/Val基因型為自變量，采用Logistic多因素回歸分析法，結果顯示Ala-9Val位點Val/Val基因型是T2DM患者發(fā)生CAS的獨立危險因素(OR=1.865，95%CI 1.086～3.200，P=0.007)。

表1 各組間一般資料的比較[±s,M(P25,P75)]

表1 各組間一般資料的比較[±s,M(P25,P75)]

項目 對照組(n=160) T2DM組(n=310) χ2P T2DM組 χ2P CAS亞組(n=186) 無CAS亞組(n=124)BMI(kg/m2) 23.85±3.16 24.22±3.11 0.118 0.908 24.35±3.04 24.01±3.26 0.130 0.718吸煙[n(%)] 70(43.75) 147(47.42) 0.326 0.754 90(48.39) 57(45.97) 0.325 0.569高血壓[n(%)] 68(42.50) 155(50.00) 0.375 0.707 100(53.76) 55(44.35) 0.139 0.933 CIMT(mm)] 0.70(0.50,0.80) 1.40(0.90,2.20) 10.984 0.001 2.00(1.70,2.70) 0.80(0.60,0.90) 7.869 0.005 FPG(mmol/L) 5.53±1.86 9.26±2.10 12.283 0.002 9.40±2.02 9.06±2.21 3.037 0.219 GHb(%) 5.14(4.86,5.82) 6.02(6.35,9.02) 0.406 0.687 9.24±1.94 6.34±2.05 4.063 0.044 TG(mmol/L) 2.20±0.64 2.27±0.59 0.125 0.903 5.33±0.58 2.18±0.62 8.644 0.003 TC(mmol/L) 4.66±1.05 4.84±0.98 4.210 0.122 5.93±0.94 4.39±1.03 4.487 0.034 LDL-C(mmol/L) 3.05±0.95 5.45±0.98 7.865 0.005 3.47±0.85 3.42±0.92 0.406 0.687 HDL-C(mmol/L) 1.14±0.36 1.09±0.35 4.487 0.034 1.06±0.33 1.13±0.38 4.210 0.122

表2 各組Mn-SOD基因Ala-9Val位點基因型和等位基因分布頻率比較

表3 T2DM患者發(fā)生CAS的危險因素分析

3 討論

已有大量研究表明機體氧化還原水平失衡與T2DM的發(fā)生、發(fā)展密切相關[8-10]，SOD是一類廣泛存在于生物體內的金屬酶，是機體重要的抗氧化物質，與過氧化氫酶(catalase,CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GPx)相互作用共同維持機體的超氧離子處于較低水平。SOD主要是以Fe-SOD，Mn-SOD和Cu/Zn-SOD等形式存在于細胞質、葉綠體、線粒體和過氧化物酶體內。Mn-SOD主要分布于細胞線粒體基質內，其是機體主要的自由基清除劑之一，對維持機體細胞氧化還原平衡具有重要作用。有研究指出T2DM患者血清Mn-SOD活性顯著低于正常對照組，且并發(fā)糖尿病視網膜病變/糖尿病腎病患者血清Mn-SOD活性水平較單純糖尿病患者下降地更為顯著[11-12]，由此可提示Mn-SOD與多種疾病密切相關。

目前，Ala-9Val是Mn-SOD基因單核苷酸多態(tài)性位點，例如GCT→GTT點突變可將Mn-SOD線粒體靶序列第9位的氨基酸由丙氨酸替換為絲氨酸，進而導致信號肽構象由親水的α-螺旋結構轉變?yōu)槭杷摩?折疊層結構，阻礙Mn-SOD在線粒體膜上的轉運，顯著降低Mn-SOD活性。大量研究結果顯示Ala-9Val位點多態(tài)性與糖尿病、糖尿病視網膜病變、糖尿病腎病、冠心病、精神分裂癥等的臨床易感性密切相關，充分證實該位點基因多態(tài)性具有實際生物學功能[13]。然而，該位點基因多態(tài)性與CAS的相關性鮮有報道。

本研究選取我院310例T2DM患者和160例健康體檢志愿者為研究對象，分別檢測和比較其Mn-SOD基因Ala-9Val位點基因型和等位基因分布頻率，結果顯示對照組和T2DM組等位基因分布頻率的差異具有統(tǒng)計學意義，兩組的Ala-9Val位點基因型分布頻率差異無統(tǒng)計學意義。該結果與相關文獻報道不同，究其原因可能與本研究納入樣本量相對較少和納入排除標準不同有關。本研究進一步探討了T2DM患者CAS亞組和無CAS亞組Ala-9Val位點基因型和等位基因的分布頻率，結果顯示兩組Ala-9Val位點基因型和等位基因分布頻率差異均具有統(tǒng)計學意義。由于Val/Val基因型是各組中分布頻率較高的Ala-9Val位點基因型，最后采用多因素Logistic回歸分析法分析T2DM患者發(fā)生CAS的危險因素，結果顯示攜帶Val/Val基因型是T2DM患者發(fā)生CAS的獨立危險因素。

國內外研究結果表明不同地區(qū)、不同種族人群Ala-9Val位點基因型和等位基因分布頻率存在顯著差異，亞洲人群中Ala等位基因分布頻率顯著低于歐洲人群[14-16]。接下來本課題組計劃擴充納入樣本的數量、區(qū)域以更全面和科學地反映Ala等位基因分布頻率與各種疾病發(fā)生發(fā)展的關聯(lián)性。

綜上所述，Mn-SOD基因Ala-9Val多態(tài)性與T2DM患者CAS相關，攜帶Val/Val基因型可能成為預測T2DM患者出現(xiàn)CAS的新指標。