肺癌患者血漿miR-3151表達(dá)水平與臨床病理特征的相關(guān)性研究

趙 格，高 瓊，余宗濤，彭春艷，張吉才

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)十堰市太和醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院，湖北十堰 442000； 2.十堰市太和醫(yī)院a.檢驗(yàn)部；b.呼吸內(nèi)科,湖北十堰 442000）

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤，死亡率高[1]。及時(shí)準(zhǔn)確的診斷是提高治療效果和患者生存率的關(guān)鍵。微小RNA（miRNA）是一類長(zhǎng)約19～25個(gè)核苷酸的非編碼RNA，主要在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)[2]。miRNA廣泛參與人類生理病理過(guò)程，其表達(dá)失調(diào)與腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展相關(guān)[3-4]。目前關(guān)于miR-3151的研究多集中在血液系統(tǒng)腫瘤上，而對(duì)于其在肺癌中的表達(dá)情況知之甚少。本研究旨在探討血漿miRNA-3151的表達(dá)水平與肺癌患者臨床病理特征的關(guān)系，并評(píng)估其應(yīng)用于肺癌診斷的可行性。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集十堰市太和醫(yī)院于2018年10月～2019年10月期間確診的120例肺癌患者的血漿樣本，其中男性82例，女性38例，平均年齡61.21±7.59歲。病理類型：腺癌65例，鱗癌37例，小細(xì)胞肺癌18例；臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期55例，Ⅲ～Ⅳ期47例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理檢查確診；②未接受任何抗腫瘤治療；③無(wú)并發(fā)其他類型腫瘤；④臨床資料完整。收集同期120例體檢健康者的血漿樣本，其中男性75例，女性45例，平均年齡59.94±7.04歲。肺癌組和對(duì)照組間性別、年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。所有受試者均征得書面知情同意，研究方案經(jīng)十堰市太和醫(yī)院臨床研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 儀器及試劑 游離miRNA提取試劑盒（磁珠法）及miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RG104-100）購(gòu)于上海匯真生物科技有限公司，TransStart@Probe qPCR SuperMix (AQ401)試劑盒購(gòu)于北京全式金生物公司。引物、探針及標(biāo)準(zhǔn)品均由上海生工生物工程有限公司合成。ABI ViiA7實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)于美國(guó)Life公司。細(xì)胞角蛋白19片段測(cè)定試劑盒（化學(xué)發(fā)光免疫分析法）、癌胚抗原測(cè)定試劑盒、神經(jīng)元特異性烯醇化酶測(cè)定試劑盒及邁瑞CL-900i全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀均購(gòu)于深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集與處理：所有受試者均采集外周靜脈血2ml，進(jìn)行第一次離心（4℃，1 600g，10min），吸取所得血漿進(jìn)行第二次離心（4℃，16 000g，10min），吸取第二次離心所得血漿置于-80°C貯存?zhèn)溆茫陨喜僮骶跇颖倦x體后1h內(nèi)完成。

1.3.2 血漿miRNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄：使用miRNA提取試劑盒按照說(shuō)明書要求提取血漿miRNA，提取所得miRNA置于-80℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩Ｄ孓D(zhuǎn)錄采用20μl體系，包含miRNA 10μl，反應(yīng)緩沖液4μl，核酸混合液4μl，酶Ⅰ0.5μl，酶Ⅱ0.2μl以及無(wú)酶水1.3μl。反應(yīng)程序?yàn)?2℃ 60min,85℃ 30s，反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行下一步操作或置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 RT-PCR反應(yīng)：RT-PCR采用20μl反應(yīng)體系：cDNA 2μl，miRNA正、反向引物各0.4μl，探 針0.4μl，2×TransStart@Probe qPCR SuperMix 10μl，Passive Reference Dye(50×)（optional）0.4μl，無(wú)酶水6.4μl。每個(gè)標(biāo)本設(shè)置3復(fù)孔，反應(yīng)程序?yàn)?4℃ 30s；94℃ 5s，60℃ 30s，45個(gè)循環(huán)。使用絕對(duì)定量的方法檢測(cè)樣本中miR-3151的表達(dá)量，以miR-126作為標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)以下公式計(jì)算樣本中miR-3151的濃度，其中C為濃度，單位是nmol/L，Ct是經(jīng)RT-PCR得到的Ct）值。

1.3.4 CYFRA21-1，NSE及CEA濃度檢測(cè)：使用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀完成各樣本中CYFRA21-1，NSE及CEA的濃度檢測(cè)，按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料服從正態(tài)分布以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，非正態(tài)分布以中位數(shù)（P25，P75）表示。兩組間數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布，差異比較采用t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，多組間比較采用kruskal-wallisH檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ROC曲線用于評(píng)估各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)對(duì)肺癌的診斷效能。

2 結(jié)果

2.1 血漿miR-3151在兩組中的表達(dá) 肺癌組及對(duì)照組血漿miR-3151（nmol/L）的表達(dá)量分別為：86.356（19.893，305.155），8.871（4.620，14.037）。與對(duì)照組相比，血漿miR-3151在肺癌組表達(dá)顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-10.039，P＜0.001）。

2.2 肺癌患者血漿miR-3151表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 見表1。比較血漿miRNA-3151的表達(dá)水平，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，Ⅲ～Ⅳ期患者高于Ⅰ～Ⅱ期患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-2.336，-2.628，均P＜0.05）。血漿miR-3151的表達(dá)水平在患者性別、年齡、吸煙史、組織學(xué)類型、腫瘤大小和分化程度之間的差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

表1 肺癌患者血漿miR-3151表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[n=120,M(P25,P75)]

2.3 血漿miR-3151，CYFRA21-1，NSE及CEA對(duì)肺癌的診斷價(jià)值 見表2。單指標(biāo)檢測(cè)時(shí)，miR-3151，CYFR21-1，NSE及CEA用于肺癌診斷的的AUC（95%CI）分別為0.875（0.830～0.919），0.704（0.639～0.770），0.769（0.707～0.830）和0.632（0.562～0.702）。兩項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)時(shí)，AUC值較單指標(biāo)檢測(cè)有進(jìn)一步提升，特別是miR-3151聯(lián)合NSE時(shí)AUC（95%CI）高達(dá)0.909（0.872～0.946），靈敏度89.2%，特異度71.7%，對(duì)肺癌的診斷效能最高。

表2 血漿miR-3151，CYFRA21-1，NSE及CEA對(duì)肺癌的診斷價(jià)值

3 討論

肺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制復(fù)雜，目前尚未完全闡明，miRNA的發(fā)現(xiàn)及其研究成果加深了我們對(duì)癌癥發(fā)生發(fā)展機(jī)制的探索。超過(guò)50%的miRNA基因定位于與腫瘤相關(guān)的基因組區(qū)域[5]，通過(guò)下調(diào)癌基因或抑癌基因而影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移[6-7]，因此miRNA的表達(dá)失調(diào)可能是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一。近年來(lái)，miRNA作為微創(chuàng)生物標(biāo)志物已顯示出良好的應(yīng)用前景。據(jù)研究，miRNA穩(wěn)定存在于血液樣本中，不受RNase降解和樣本多次凍融的影響[8]，檢測(cè)外周血中miRNA的表達(dá)情況，對(duì)腫瘤的早期診斷和預(yù)后評(píng)估意義重大。馮磊等[9]研究發(fā)現(xiàn)，與宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變患者和健康女性相比，血漿miR-10b在宮頸癌患者中表達(dá)上調(diào)，對(duì)宮頸癌早期診斷具有較高的診斷價(jià)值。黃剛等[10]研究認(rèn)為，檢測(cè)血漿miR-145和miR-221的表達(dá)有助于監(jiān)測(cè)非小細(xì)胞肺癌術(shù)后復(fù)發(fā)。

目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于miR-3151的研究多集中在血液系統(tǒng)腫瘤中，而在實(shí)體瘤中的研究報(bào)道較少。有研究發(fā)現(xiàn)，在急性髓系白血病[11-13]、BRAF突變的惡性黑色素瘤和甲狀腺乳頭狀癌[14]中，miR-3151充當(dāng)促癌基因，通過(guò)下調(diào)抑癌基因TP53的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，影響預(yù)后。在本研究中，我們利用磁珠技術(shù)高效分離miRNA，并采用高靈敏度、高特異度的TaqMan定量PCR方法檢測(cè)肺癌患者和健康人血漿中miRNA-3151的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血漿miRNA-3151在肺癌組中的表達(dá)顯著高于對(duì)照組，在伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Ⅲ～Ⅳ期患者中的表達(dá)高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Ⅰ～Ⅱ期患者，miRNA-3151的高表達(dá)提示腫瘤進(jìn)展。我們的結(jié)果與之前的文獻(xiàn)報(bào)道相似，提示miRNA-3151可能充當(dāng)促癌基因參與肺癌的發(fā)生及進(jìn)展。

尋找無(wú)創(chuàng)或微創(chuàng)并且具有較高靈敏度和特異度的腫瘤標(biāo)志物,有助于腫瘤的早期診斷及預(yù)后預(yù)測(cè),對(duì)于改善腫瘤病人的預(yù)后具有重要的臨床意義。CYFRA21-1，NSE及CEA是目前臨床上常用的肺癌診斷標(biāo)志物，但是它們的靈敏度和特異度較低，在一定程度上使用受到限制。本研究進(jìn)一步分析比較了血漿miR-3151，CYFRA21-1，NSE及CEA對(duì)肺癌的診斷能力，結(jié)果顯示，單項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)時(shí)，血漿miR-3151對(duì)肺癌的診斷價(jià)值優(yōu)于后三者；兩項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)時(shí)，診斷效能較單項(xiàng)指標(biāo)有進(jìn)一步提升，特別是miR-3151聯(lián)合NSE時(shí)，對(duì)肺癌的診斷效能最高，AUC為0.909，靈敏度89.2%，特異度71.7%，均高于任一單獨(dú)指標(biāo)。

綜上所述，miR-3151在肺癌患者血漿中高表達(dá)，與患者的臨床指標(biāo)相關(guān)，可能參與肺癌的發(fā)生發(fā)展。血漿miR-3151是有前景的肺癌微創(chuàng)診斷標(biāo)志物，與傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)將進(jìn)一步提高對(duì)肺癌診斷的準(zhǔn)確度。在未來(lái)的研究中，我們將探索miR-3151在肺癌中的調(diào)控機(jī)制，以期為肺癌診治提供新思路。