類風濕性關節炎患者血清RA-CP，抗CCP抗體及RF檢測對RA的實驗診斷意義

陳建蕓，廖海平，孫朝暉，李林海，張宏斌（南部戰區總醫院.檢驗科；.醫學實驗科,廣州 510010）

類風濕性關節炎（RA）是一種慢性自身免疫性疾病，在世界范圍內的發病率約為1%[1]。針對瓜氨酸化蛋白的自身免疫性可能與RA的發病機制相關，因此，跟蹤該自身免疫性路徑（自身免疫性抗原）有望發現該疾病發病機理的更多證據。盡管在RA的實驗室診斷和監測中，監測針對血清中的瓜氨酸化肽，尤其是抗環瓜氨酸多肽（CCP）的抗體是診斷RA的標準檢測靶標，但很少有研究關注血清或血漿中瓜氨酸化蛋白測定對RA診斷的臨床應用意義。本研究采用了一種新型的類風濕性關節炎特異性抗原瓜氨酸化蛋白（RA-CP）測定試劑盒，測定的標志物是一組類風濕性關節炎特異性的瓜氨酸化蛋白抗原，比較分析了RA患者血清中RA-CP與傳統的國際指南靶標抗CCP抗體及RF的水平，對其臨床的診斷價值進行了分析。

1 材料與方法

1.1 研究對象 RA組選擇2019年3月至2019年5月在中國人民解放軍南部戰區總醫院門診及住院就診的RA患者共103例，其中女性78例，男性25例，年齡17～86歲平均年齡52歲，診斷符合2010年ACR與歐洲風濕病學會（EULAR）聯合修訂的RA分類標準。健康對照組選擇健康體檢者共105例，女性48例，男性57例，年齡22～88歲，平均年齡50歲。疾病對照組選擇系統性紅斑狼瘡（SLE）25例，痛風性關節炎14例，硬皮病12例，舍格倫綜合征（SS）10例，骨關節炎（OA）5例，強制性脊柱炎（AS）5例。抽取被檢者的早晨空腹靜脈血3ml（不抗凝），離心收集血清，-80℃凍存待檢。

1.2 主要試劑與儀器 RA-CP檢測試劑盒（廣州市雷德生物科技有限公司），抗CCP抗體檢測試劑盒（德國歐蒙公司），RF檢測試劑盒及特種蛋白儀（德國西門子公司）。Spectramax M3多功能酶標儀（美國Molecular Devices公司）。

1.3 方法

1.3.1 測定方法：血清RA-CP和抗CCP抗體測定采用ELISA方法，血清RF測定采用特種蛋白儀及配套試劑。RA-CP和抗CCP抗體的檢測按照試劑盒說明書和酶標儀的操作說明書進行，采用A450nm和A630nm雙波長讀取吸光度A值，測定結果根據試劑盒說明書提供的參考值計算樣本的吸光度比值（即樣本吸光度值AS與臨界對照吸光度值ACO的比值，AS/ACO），AS/ACO比值等于1濃度計為1個單位（≥1為陽性）。RF測定結果根據定標曲線進行定量。

1.3.2 結果計算：分別計算RA-CP，抗CCP抗體和RF對RA診斷的敏感度、特異度、陽性似然比和陰性似然比。用GraphPad prism 7.0軟件繪制受試者工作特征曲線（ROC曲線）并計算曲線下面積（AUC）。

1.4 統計學分析 實驗數據采用SPSS24.0進行統計學分析，非正態分布計量資料用中位數和四分位數描述，配對樣本的非參數檢驗采用McNemar檢驗。不同檢測指標對RA診斷的應用價值用ROC曲線進行評估。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 RA-CP對不同血清類型RA的檢出率 根據抗CCP抗體和RF的檢測結果將RA患者分為四種血清類型，分別為抗CCP抗體陽性/RF陽性RA、抗CCP抗體陽性/RF陰性RA、抗CCP抗體陰性/RF陽性RA和抗CCP抗體陰性/RF陰性RA。RA-CP在四種血清類型RA中的檢出率分別為100.0%（57/57），40.0%（4/10），100.0%（15/15），19.0%（4/21）。在36例抗CCP抗體陰性的RA患者中，19例RA-CP檢測為陽性，檢出率為52.8%。

2.2 RA-CP檢測對RA診斷的效能 RA組的RA-CP濃度水平中位數（四分位間距）為4.51（1.80～7.49）單位，高于其他疾病組的0.53（0.40～0.76）單位和健康對照組的0.52（0.35～0.69）單位，見圖1。RA-CP在RA組、其他疾病組和健康對照組中的陽性檢出率分別為77.7%，8.5%和2.0%，在RA組的陽性檢出率高于其他疾病組和健康對照組。

圖1 不同類型樣本組RA-CP濃度比較

2.3 血清中RA-CP，抗CCP抗體、RF的比較 三種指標的ROC曲線見圖2。RA-CP，抗CCP抗體、RF檢測對RA診斷的曲線下面積分別為0.854（95%CI：0.797～0.911），0.820（95%CI：0.760～0.879），0.812（95%CI：0.754～0.871），敏感度分別為77.7%，65.0%，69.9%，見表1。特異度分別為95.5%，97.2%，89.2%。采用配對設計的樣本率比較的McNemar檢驗顯示，RA-CP在RA患者血清中的敏感度高于抗CCP抗體和RF，差異具有統計學意義（P=0.015，0.008，均P＜0.05）。單指標中，抗CCP抗體的特異度和陽性似然比最高，分別為97.2%和23.2；RA-CP的敏感度最高，陰性似然比最低，分別為77.7%和0.234（見表1）。

表1 三種指標單獨和聯合檢測診斷RA效能的比較

三種指標中的兩個或三個進行組合分析診斷的敏感度和特異度結果顯示：RA-CP與抗CCP抗體兩者的組合檢測能提高RA診斷的敏感度，與RF兩者或三者組合檢測的特異度均會下降。RA-CP和抗CCP抗體組合的特異度和敏感度均高于或等于其它組合，分別為93.8%和83.5%。

圖2 RA-CP，抗CCP抗體、RF用于RA診斷的ROC曲線

3 討論

抗瓜氨酸化蛋白抗體（ACPA）被認為是RA最重要的有診斷意義的生物標記物，也是多年來RA最熱門的研究方向。SCHELLEKENS等[2]和GIRBAL-NEUHAUSER等[3]分別于1998年和1999年證實瓜氨酸殘基是RA特異性的抗聚絲蛋白抗體（AFA）所識別的主要抗原表位。DESPRES等發現的Sa抗原后來被研究證實為瓜氨酸化的波形蛋白，巨噬細胞內含有Sa抗原，當滑膜炎時會有大量的巨噬細胞聚集，巨噬細胞活化后可向細胞外分泌瓜氨酸化的波形蛋白[4-5]。研究發現抗瓜氨酸化蛋白的抗體可由炎癥關節局部的B細胞產生，由此推斷關節內可能存在瓜氨酸化抗原[6]。催化蛋白內精氨酸轉化為瓜氨酸的酶-肽酰精氨酸脫亞氨基酶（PAD），存在于滑膜組織等多種組織和細胞中，因此關節局部可以產生瓜氨酸化蛋白。瓜氨酸化的纖維蛋白α鏈和β鏈被證實存在于滑膜內，而且被AFA識別[7]，這說明瓜氨酸化的纖維蛋白在RA的發病機制中可能發揮著重要的作用。近年來人們利用PAD酶在體外使蛋白瓜氨酸化或合成含有瓜氨酸多肽的方法先后發現了多種RA中可能存在的瓜氨酸化抗原，包括瓜氨酸化的Ⅱ型膠原、纖維連接蛋白、α-烯醇酶等[8]。

在2010年ACR與歐洲風濕病學會（EULAR）聯合修訂的RA分類標準中，ACPA和RF作為RA血清檢測的指標被應用在指南中[9]。隨著RA相關新的自身抗體不斷發現，研究表明這些抗體對RA不但單獨具有一定的診斷意義[10]，而且不同自身抗體組合檢測可提高RA的臨床診斷[11]。另外，ACPA和RF均屬于自身抗體，文獻報道抗CCP抗體和RF有顯著的相關性[12]，二者應該屬于同類性質的檢測靶標。ACPA種類很多，包括抗角蛋白抗體（AKA）、AFA，抗核周因子抗體（APF）、抗瓜氨酸化波形蛋白抗體（MCV）和抗CCP抗體等。抗CCP抗體檢測產品目前已開發到第3代（CCP3），雖然CCP2和CCP3聯合檢測可以提高RA的診斷，但二者單獨檢測卻無顯著性差異[13]。因此以第二代CCP（CCP2）最為常見，雖然其特異度很高（95.3%），且具有較高的敏感度（71.6%）[14]，但仍有20%～30%的RA患者抗CCP2抗體檢測結果為陰性。RF特異度差，在其他自身免疫性疾病、慢性感染性疾病中也常呈現陽性。除本研究外，目前沒有文獻報道對血清或血漿中類風濕性關節炎瓜氨酸化蛋白（RA-CP）測定的臨床應用研究。

從檢測原理上對比，RA-CP檢測的是抗原，ACPA和RF均屬于檢測自身抗體，檢測抗原更具有早發現和早診斷的技術優勢。而且體內存在細胞免疫和體液免疫兩條途徑，部分自身免疫不產生抗體，這可能就是部分RA患者臨床抗CCP抗體檢測陰性的原因。本研究通過單項指標檢測結果的分析同樣顯示，RA-CP對RA具有很好的診斷價值，與抗CCP抗體和RF相比，RA-CP可以檢出超50%的抗CCP抗體陰性RA，極大地提高了血清陰性RA的檢出率；而且通過聯合檢測分析，RA-CP與抗CCP抗體的組合檢測可顯著提高RA診斷的敏感度且保持高的特異度，聯合診斷效能高于目前臨床采用的抗CCP抗體與RF的組合。綜上所述，RA-CP作為一種新的檢測靶標，不僅與RA自身免疫的發病機制有著密切的相關性，而且可以作為RA臨床診斷的新指標并有望成為更有效的輔助診斷指標。